彗星實驗（Comet assay）也被稱為單細胞凝膠電泳實驗（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的技術。當各種內源性和外源性 DNA 損傷因子誘發細胞 DNA 鏈斷裂時，其超螺旋結構受到破壞，在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜等膜結構受到破壞，細胞內的蛋白質、RNA 以及其他成分均擴散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進入凝膠而留在原位。電泳過程中，如果DNA沒有損傷，則將停留在原位，染色后呈圓形的熒光團，無拖尾出現。如果DNA受損，斷裂的碎片進入到凝膠中，在電場的作用下，DNA碎片離開原位向陽極遷移，形成拖尾。DNA受損越嚴重，斷裂越多，產生的碎片就越多、越小，則向陽極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長，熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長并且熒光強度增強。

目前有兩種常見的彗星實驗檢測方式——堿性處理&中性處理。在堿性處理條件下，DNA發生變性，因而可檢測包括單鏈及雙鏈斷裂在內的所有DNA 損傷；在中性處理條件下，DNA 維持雙鏈構象，因而僅可以檢測雙鏈斷裂。

實驗大體流程如下：

1. 制備單細胞懸浮液，在 37℃ 條件下，懸浮液與低熔點瓊脂糖（LM瓊脂糖）混合；

2. 將瓊脂糖、細胞混合物涂布在預處理的載玻片上；

3. 4℃條件下用裂解液處理30-60min或過夜，裂解液由去垢劑及高鹽溶液組成，可去除多余的細胞膜及組蛋白；

4. 將載玻片浸入電泳溶液中；

5. 進行凝膠電泳，隨后，中和載玻片，待LM瓊脂糖*干燥后，用熒光染料染色，并于熒光顯微鏡下觀察DNA損傷程度。

注：常用的熒光染料是SYBR Gold，但熒光染料的觀察需要熒光顯微鏡。如果選擇銀染，使用標準的光學顯微鏡觀察即可。

圖片處理

在拍照時以tif格式保存圖片，然后用CASP彗星分析軟件分析，如下圖是軟件打開的界面?

接下來?導入圖片，用白色畫框選中要分析的區域。下圖中的“調整”項可以調整畫框的位置以包含整個細胞，開始分析前要點擊“開始”，然后點“分析”，再點“保存”，這樣一張圖的數據就分析完了，數據會保存在系統里。點擊“翻頁”可以繼續分析下一張圖。

分析完所有圖片后導出數據到Excel表格，保留TailDNA%（尾部DNA百分含量），TailLength（尾長），TailMoment（尾矩）三列數據。根據細胞尾部的DNA百分含量（即TailDNA%），將采集的細胞圖像分為5級：彗星尾部熒光強度（TailDNA%）占總強度為0-6%是0級；6.1%-17.0%是1級；17.1%-35.0%是2級；35.1%-60.0%是3級；60.1%-100.0%是4級。

彗星率等于彗星細胞數目（除去0級細胞）占總細胞數目的百分比。任意值等于各等級細胞的百分比與其對應的級別號的乘積之和，它可以綜合反映細胞的DNA損傷情況。后，綜合分析Tail DNA%、Tail length、Tail moment、彗星率和任意值，共5個指標比較細胞的DNA損傷程度。

Trevigen作為一家專注于開發細胞凋亡、DNA損傷和修復、腫瘤細胞功能與行為等相關研究產品的美國生物技術公司，擁有彗星實驗全線產品：

Trevigen是一家快速成長的美國生物技術公司，專注于細胞凋亡、DNA損傷和修復、腫瘤細胞功能與行為等方面研究的腫瘤研究產品和服務。作為 Trevigen在中國區域的總代理，艾美捷與Trevigen一道為中國的科研工作者提供超好的氧化應激、細胞損傷和腫瘤細胞行為研究等領域內的 產品和技術服務。