皮質醇ELISA試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定其他血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中皮質醇含量。

艾美捷皮質醇ELISA試劑盒#K003-H1：

檢測范圍：0.375nmol/L~12nmol/L

靈敏度：0.1

實驗原理：將皮質醇(Cor)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的皮質醇(Cor)與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的皮質醇(Cor)抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次徹-底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的皮質醇呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(0.D.值),計算樣品濃度。

皮質醇ELISA試劑盒組分：

皮質醇ELISA試劑盒需自備的設備及試劑：

1. 450±10m濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)

2. 單道或多道微量加液器及吸頭

3. 稀釋樣品的印管

4. 蒸餾水或去離子水

5. 吸水紙

6. 盛放洗液的容器

試劑盒的儲存及有效期：

1. 未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將TMB洗滌液，終止液保存于4℃,其他試劑保存于-20℃。

2. 使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20°℃,避免潮濕。

注意：

試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在*實驗后1個月內使用完畢。產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩定的。

皮質醇ELISA試劑盒標本的采集與保存：

1. 血清：

將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4°℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80°℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：

用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8°℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20°℃或-80°℃保存，但應避免反復凍融。

3.組織勻漿：

1)取適量組織塊，于預冷PBS(0.01mol/L.pH 7.0-7.2)中清洗去除血液，稱重后備用(組織塊較大需先剪碎后再勻漿);

2)可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL預冷PBS進行充分研磨，該過程需在冰上進行(有條件實驗室可選用機器勻漿);得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理(超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2次)。

3)將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測。

4.細胞裂解液：

1)貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞(懸浮細胞可直接離心收集);

2)將收集到的細胞用冷PBS洗3次；

3)物理方法裂解細胞(可先超聲破碎細胞，再反復凍融):

i超聲破碎：取適量PBS重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。

ii反復凍融：將待破碎的細胞在-200C以下冰凍，室溫融解，反復3次，使細胞溶脹破碎。

4)將標本于2-8 °℃1500×g離心10分鐘，收集上清備用。

5.細胞培養上清或其它生物標本：

請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20°℃或-80°℃保存，但應避免反復凍融。注意：

1. 以上標本均需密封保存，4℃保存應小于1周，-20℃不應超過1個月，-80°℃不應超過2個月。

2. 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。

3. 實驗前紅細胞裂解液必須用標準品稀釋液稀釋。

皮質醇ELISA試劑盒試劑準備

1. 使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-250C),試劑不能直接在370C溶解。

2. 標準品(凍干品):每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL,蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1000ng/mL。準備7個稀釋標準品的印管，每個EP管中加入150μL的標準品稀釋液，依次倍比稀釋成不同的梯度， 標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

3. 濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL,進行30倍稀釋。

皮質醇ELISA試劑盒操作步驟：

1. 加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μ1,待測樣品孔中先加樣品

稀釋液40μ1,然后再加待測樣品10μ (樣品*終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

3. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

5. 加酶：每孔加入酶標試劑50μ1,空白孔除外。

6. 溫育：操作同3。

7. 洗滌：操作同5。

8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μ1,再加入顯色劑B50μ1,輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

9. 終止：每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

10. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

特異性

本試劑盒用于檢測皮質醇(Cor),經檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。

由于受到技術及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關或相似物質交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經檢測的其它物質有交叉反應。

精密度

精密度用樣品測定值的變異系數CV表示。CV(%)= SD/mean×100

批內差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測.每份樣本連續測定20次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復測定8次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內差： CV<10%

批間差： CV<12%

皮質醇ELISA試劑盒穩定性：

經測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對試劑金破壞前后檢測值的影響，實驗室的環境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。