FlyCut™ 酶是一系列能夠快速消化DNA的工程限制性酶。所有FlyCut™酶在通用CutOne中顯示出優(yōu)異的活性™ 和CutOne™ 彩色緩沖液，能夠在5~15分鐘內(nèi)消化DNA。這使得任何限制性酶的組合都能在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)工作，并消除了連續(xù)消化的需要。FlyCut™ 酶已通過多項(xiàng)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可用于消化質(zhì)粒、基因組和病毒DNA以及PCR產(chǎn)物。CutOne™ Color Buffer包括密度試劑以及紅色和黃色跟蹤染料，可以將反應(yīng)混合物直接裝載在凝膠上。CutOne的紅色染料™ 彩色緩沖液在1%瓊脂糖凝膠中與2.5kb雙鏈DNA片段一起遷移，黃色染料在1%瓊脂凝膠中與10bp雙鏈DNA碎片一起遷移。

艾美捷快速內(nèi)切酶EcoRV：

Cat #: C-BSM537

Size: 200 rxns

Storage: -20°C

快速內(nèi)切酶EcoRV組分：

推薦反應(yīng)條件

1x CutOne“"緩沖器；在37°C下培養(yǎng)；有關(guān)反應(yīng)設(shè)置，請(qǐng)參閱“快速DNA消化方案"。

熱滅活

在80°C下培養(yǎng)20分鐘。

質(zhì)量控制

功能測(cè)試

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“"EcoRV的CutOne“緩沖液中，在37°C下孵育15分鐘，20μl反應(yīng)可通過瓊脂糖凝膠電泳確定完-全消化。

長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)/星形活性測(cè)定

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“EcoRV的CutOne"緩沖液中，在37℃下孵育3小時(shí)，反應(yīng)20μl，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到DNA模式?jīng)]有可檢測(cè)的核酸酶降解。長(zhǎng)期孵育可能導(dǎo)致星形活性。

結(jié)扎和清算

在37℃下用FlyCut’“"EcoRV消化10倍后，在22°C下可將>95%的DNA片段與T4 DNA配體連接。在這些連接的片段中，通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，>95%可以用FlyCut“"EcoRV重新切割。

非特異性核酸內(nèi)切酶活性

在含有1μg超螺旋質(zhì)粒和1μl FlyCut“"EcoRV的CutOne“緩沖液中，在37℃培養(yǎng)4小時(shí)，進(jìn)行20μl反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，轉(zhuǎn)化為刻痕或線性形式的轉(zhuǎn)化率<10%。

藍(lán)/白篩選試驗(yàn)

用1μl FlyCut消化含有lacZα基因的合適載體™ EcoRV。將消化產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在含有X-Gal、IPTG和適當(dāng)抗生素的Luria Bertani培養(yǎng)板上，成功連接的β-半乳糖苷酶基因可以表達(dá)并產(chǎn)生藍(lán)色菌落，而中斷基因（即降解的DNA末端）產(chǎn)生白色菌落。FlyCut™ 限制性內(nèi)切酶必須產(chǎn)生少于1%的白色菌落。

在推薦的反應(yīng)條件下，該酶可在5~15分鐘內(nèi)消化單位底物。酶的最適反應(yīng)溫度為37℃。

當(dāng)?shù)孜?span style="font-family: Calibri;">DNA被CpG甲基化酶甲基化時(shí)，這種限制性酶的切割可能被阻斷或受損。

當(dāng)?shù)孜?span style="font-family: Calibri;">DNA被EcoBI甲基化酶甲基化時(shí)，這種限制性酶的切割可能被阻斷或受損。

該酶可以在80°C下孵育20分鐘進(jìn)行熱滅活。孵育3小時(shí)不會(huì)顯示星形活性，但孵育時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致星形活性。

快速DNA消化方案：

① 按照指示的順序在冰上混合下列反應(yīng)組分

Plasmid DNA    PCR product    Genomic DNA

ddH?O    15μl   16μl    30μl

10x CutOne' Buffer or 10xCutOne Color Buffer2μl    3μl2    5μl

DNA    2μl(up to 1μg)   10μ(～0.2μg)    10μl(5μg)

FlyCut" EcoRV 1μl   1μl    5μl

Total    20μl   30μl    50μl

對(duì)于純化的PCR產(chǎn)物。如果PCR產(chǎn)物未純化，則10×CutOne的量™ 緩沖液應(yīng)減少到2μl，以減少未純化的PCR產(chǎn)物中剩余的金屬離子。我們建議在消化前純化PCR產(chǎn)物，將其用于克隆，因?yàn)橐恍?span style="font-family: Calibri;">DNA聚合酶的核酸外切酶活性可能會(huì)改變切割DNA的末端

② 輕輕混合并向下旋轉(zhuǎn)；

③ 在37°C下培養(yǎng)15分鐘（質(zhì)粒DNA）或15～30分鐘（PCR產(chǎn)物）或30～60分鐘（基因組DNA）；

④可選：在80°C下加熱20分鐘使酶失活；

⑤如果CutOne™ 在反應(yīng)中使用顏色緩沖液，將反應(yīng)混合物的等分試樣直接裝入凝膠中。