基于重組原理的無縫克隆技術(shù)是一種新一代的克隆方法，不需要繁瑣的酶消化、連接步驟或末端拋光。它允許通過將DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列重組，將插入片段克隆到線性化載體的任何位置。該載體的自連接背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。FlyCut™ DNA組裝Mix-Plus無縫克隆試劑盒能夠在單個(gè)反應(yīng)中重組單個(gè)或多個(gè)DNA片段。它可以在5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)單片段重組，陽性率超過95%。添加到混合物中的輔助因子有效地提高了克隆陽性率，優(yōu)化的反應(yīng)系統(tǒng)可以在一定程度上耐受未純化的PCR產(chǎn)物中的雜質(zhì)。無血清克隆試劑盒的升級版具有更高的陽性率和更好的兼容性。

艾美捷快速多片段DNA無縫克隆預(yù)混液：

Cat #: C-BSM1202

Size: 50 rxns

Storage: -20°C

快速多片段DNA無縫克隆預(yù)混液：

組件   規(guī)格

FlyCut“DNA組裝混合物+250μl

pUC19對照質(zhì)粒，線性化（安培，40納克/μl）50μl

500 bp對照片段（20納克/μl）50μl

快速多片段DNA無縫克隆預(yù)混液使用說明：

1.工作流程概述

2.線性化克隆載體的制備

選擇合適的克隆位點(diǎn)并將載體線性化。載體的線性化可以通過酶切或反向PCR擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)。

① 酶消化制劑

一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA，這可能導(dǎo)致不同數(shù)量的載體DNA未消化，導(dǎo)致陽性率降低。建議使用FlyCutTM快速限制酶進(jìn)行消化（單次或雙次消化），以確保載體的完-全線性化并減少轉(zhuǎn)化背景（從未消化的載體中獲得假陽性克隆）。

注1：通過酶消化制備的線性化載體不需要去磷酸化。建議進(jìn)行雙重消化。

注2：消化后，建議滅活限制性內(nèi)切酶或純化所需產(chǎn)物，用于組合反應(yīng)。

② 反向PCR擴(kuò)增制備

為了盡量減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真度PCR混合物進(jìn)行擴(kuò)增。建議使用預(yù)線性化的質(zhì)粒作為模板，以減少殘留的環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。

注1：如果PCR產(chǎn)物沒有顯示出特定的條帶，建議使用模板消除劑消化質(zhì)粒模板，用于重組反應(yīng)。否則，建議對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

注2：對于多片段克隆，建議在使用前對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

3.插入片段的PCR引物的設(shè)計(jì)

PCR引物的5'端必須包含與相鄰片段（插入片段或載體）端同源的15~25nt（推薦18nt）序列。如果矢量有粘性末端，并且3'末端突出，則底漆設(shè)計(jì)必須包括突出部分。如果5’端突出，底漆設(shè)計(jì)可以包括或排除突出部分。插入片段的正向擴(kuò)增引物：

5'-上游載體同源序列+限制性位點(diǎn)（可選）+基因特異性正向擴(kuò)增

序列-3'

插入片段的反向擴(kuò)增引物：

3'-基因特異性反向擴(kuò)增序列+限制性位點(diǎn)（可選）+下游同源載體

序列-5'

注1：建議選擇沒有重復(fù)序列、GC含量一致的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上游和下游的25nt區(qū)域中的GC含量在40%和60%之間時(shí)，實(shí)現(xiàn)了較高的重組效率。

4.插入片段的PCR擴(kuò)增

建議使用高保真度PCR混合物，以盡量減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng)。如果通過瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以直接使用，但添加的體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。

5.重組反應(yīng)

6.重組產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化

取5-10μl反應(yīng)混合物，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕移液管并緩慢混合，然后放在冰上30分鐘。在42°C下加熱休克45-60秒，然后在冰上孵育5分鐘。加入500μl SOC或LB培養(yǎng)基，在37℃下振蕩40-60分鐘（200 rpm）。將細(xì)菌溶液均勻地涂抹在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂板上，并在37°C下孵育過夜。

7.陽性克隆檢測：

取單個(gè)菌落與10μl ddH20混合。在95°C下孵育10分鐘進(jìn)行裂解后，取1μl裂解液作為平板進(jìn)行菌落PCR鑒定。或者，將單個(gè)菌落接種在含有抗生素的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶消化鑒定。對于陽性克隆檢測中的陽性對照，使用通用引物M13F和M13R進(jìn)行克隆PCR，使用Hindll和EcoRI進(jìn)行酶消化鑒定。

注1：建議在菌落PCR中至少使用一種通用引物，以避免假陽性結(jié)果。

注2：如有必要，可對陽性結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步測序鑒定。