CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）是一種用于研究內源蛋白質與DNA相互作用的新技術。它是在2017年由染色質研究領域的大牛Steven Henikoff實驗室發明的。這個方法結合了抗體靶向和原位核酸酶剪切的優勢，提供了一種高效且精準的方法來分析染色質蛋白結合位點。 類似于ChIP（chromatin immunoprecipitation），CUT&RUN也是利用抗體靶向染色質相關修飾和蛋白，但其所需細胞量和測序深度比傳統ChIP更低。

CUT&RUN實驗可以用來分析多種蛋白的染色質圖譜，包括PTMs，轉錄因子，染色質remodelers和染色質writers/readers。

CUT&RUN原理：

跟ChIP的靶點覆蓋范圍類似，CUT&RUN也適用于研究組蛋白修飾、轉錄因子、染色質修飾酶以及其他DNA結合蛋白在基因組上的結合位點。但跟ChIP不同的是，CUT&RUN是通過抗體靶向和核酸酶原位切割的方法，將目的蛋白結合的DNA從染色質上切割并釋放出來。CUT&RUN的主要步驟是首先將細胞通透化，隨后加入目的蛋白抗體特異性的結合在目的蛋白處，并招募和protein A/G偶聯的微球菌核酸酶（pA/G-MNase），最后加入Ca2?激活MNase活性，切割目標區域的DNA并回收，用于qPCR檢測或NGS建庫測序。

CUT&RUN實驗流程：

1. 收獲細胞并和beads結合：

收獲細胞，并且進行細胞計數，推薦起始細胞數量5千-50萬個。用室溫的wash buffer對細胞清洗兩次后加入ConA beads，室溫下溫柔孵育5-10min，使細胞結合在beads上。  

2. 細胞通透化處理和一抗孵育

在細胞和beads結合之后，將管子轉移到磁力架上棄去上清，并加入適量抗體結合buffer重懸beads。按照1:100或者廠家推薦的濃度加入一抗，室溫孵育2h或4℃孵育過夜。

3. 結合pA/G-MNase融合蛋白

抗體孵育完成后，將管子轉移到磁力架上棄去上清，并加入適當清洗溶液清洗2-3次，去除未結合到目的蛋白上的多余游離抗體。最后一步清洗完成后，用含有pA/G-MNase融合蛋白的溶液重懸ConA beads，孵育時間最短可以室溫孵育10分鐘，或者可以4℃孵育1個小時。這一步是為了使MNase通過其融合的protein A/G被抗體招募到目的蛋白結合處。

4. DNA片段化與純化

pA/G-MNase孵育完成后，將管子轉移到磁力架上棄去上清，并加入適當清洗溶液清洗2-3次，去除沒有結合到目的蛋白上的游離pA/G-MNase。最后一步清洗完成后，將管子放置在冰上，加入鈣離子激活結合到目的蛋白上的pA/G-MNase，使其可以切割目的蛋白結合的DNA，此步孵育反應在冰上進行。切割完成后加入反應終止液，并在37℃孵育30分鐘，這是為了將被切割的DNA釋放到上清中。隨后將管子轉移到磁力架上吸附，小心地將上清轉移到新的離心管子中。這里就是目的蛋白結合的DNA，隨后進行DNA進行純化回收。

DNA純化回收后，可以進行文庫構建，然后送測序分析。對于太少的細胞，Epigentek不太推薦做qPCR，因為起始細胞比較少，得到的目的DNA量非常低，qPCR的循環數會非常高。

艾美捷 EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒使用指南：

旨在從微量RNA輸入中富集含有m6A的RNA片段，并為使用Illumina平臺（如Illumina Genome Analyzer II、HiSeq和MiSeq系統）的下一代測序準備文庫。試劑盒的創新工作原理、優化的協議和組分允許以最小的非特異性背景水平捕獲m6A片段。富集的RNA特別適合快速構建非條形碼（單重）和條形碼（多重）文庫，允許以較小的偏差和高分辨率映射m6A區域。

輸入量： 一般來說，每個反應的總RNA量可以是1微克到20微克。為了最佳準備，輸入量應該是10微克RNA，盡管使用總量低至500納克的RNA也可以獲得CUT&RUN RNA m6A-Seq數據。

起始材料： 起始材料可以包括各種哺乳動物細胞樣本，如來自培養瓶或板的培養細胞、從血液、體液和新鮮/冷凍組織中分離的原代細胞或稀有細胞群體、從整個細胞群體中分選的特定細胞和胚胎細胞等。

抗體： 該試劑盒中使用的抗m6A兔多克隆抗體對m6A RNA片段具有高度特異性，具有MeRIP級，并且不與未甲基化的腺嘌呤RNA片段發生交叉反應。

內部對照： 該試劑盒提供了一個陰性對照非免疫IgG。

注意事項： 為了避免交叉污染，請小心地將樣本或溶液滴入試管中。使用防氣溶膠的移液管頭，并在液體轉移之間始終更換移液管頭。在整個過程中佩戴手套。如果手套與樣本接觸，請立即更換手套。