Nephrin（足蛋白）是一種在足細胞中表達的跨膜蛋白，足細胞是覆蓋在腎小球基底膜外側的臟層上皮細胞。這些細胞具有交錯的足突，形成裂孔隔膜，調節血漿蛋白通過腎小球屏障的通過，因此發揮過濾功能。Nephrin基因突變、Nephrin產生異常以及足細胞功能異常均會導致蛋白尿，這種情況常見于影響腎小球的疾病，如腎病綜合征和糖尿病。腎臟損傷可能伴隨Nephrin釋放和/或足細胞脫落進入尿液。動物和糖尿病患者的研究支持Nephrin尿是腎臟損傷和疾病中腎小球損傷的標志物，并且可能反映損傷的嚴重程度。檢測尿液中的Nephrin可能有助于早期發現腎功能異常和/或評估腎臟對治療干預的反應。

艾美捷Ethos Biosciences-人Nephrin ELISA試劑盒【#1035】使用人Nephrin（hNephrin）作為標準品，并采用針對人Nephrin N端的鼠單克隆抗體。這種抗體不會與人白蛋白發生交叉反應。人Nephrin ELISA是一種間接競爭性ELISA，結果以ug/ml hNephrin報告。檢測板預先涂有hNephrin。將稀釋的標準品和樣本分別加入相應的孔中。加入抗hNephrin抗體，該抗體與固定相的Nephrin或流動相中的Nephrin結合，因此稱為競爭性結合。然后洗去未結合的反應物，并與抗小鼠IgG HRP偶聯物完成反應。偶聯物與結合到固相抗原的抗體結合，用酶標記它。洗去后，加入顯色底物。經過短暫孵育后，用酸終止反應。檢測中的顏色強度與初始流動相中人Nephrin濃度的對數成反比。人Nephrin ELISA是一種用于測量人尿液樣本中Nephrin的競爭性ELISA，僅供研究目的。

樣本采集與儲存：采集不含防腐劑的尿液樣本。冷凍并儲存于-60°C，最長可達2個月。檢測前，讓樣本恢復至室溫。解凍冷凍樣本時不要加熱。樣本應混合均勻，并靜置至少15分鐘，以便顆粒沉降。

人Nephrin ELISA試劑盒組成：

- 1塊人Nephrin檢測板

- 2瓶EIA稀釋液

- 1瓶人Nephrin標準品

- 1瓶抗人Nephrin小鼠單克隆抗體（抗體）

- 1瓶抗小鼠IgG HRP偶聯物

- 1瓶TMB顯色劑

- 1瓶酸性顯色終止液

- 1份說明書

人Nephrin檢測板已預先涂覆，可直接使用。試劑盒中的所有試劑均以即用型液體形式提供。

所需材料和設備（試劑盒中未包含）：

- 洗滌緩沖液：Ethos Biosciences EIA洗滌緩沖液效果良好。含0.05% Tween 20的PBS也可接受。水是不可接受的。

- 微量移液器和多通道移液器及吸頭

- 稀釋用試管（Microfuge試管效果良好）

- 需要配備450 nm吸光度測量功能的酶標儀

檢測程序：

在運行檢測前，讓試劑恢復至室溫。標準品和樣本應輕輕混合，然后靜置至少15分鐘，以便顆粒沉降。這些說明旨在使用每個標準稀釋度和每個樣本稀釋度的雙孔完成檢測。這種設計允許包含對照、標準曲線，并可分析多達40個樣本。

標準品稀釋：

此程序描述了制備七個（7）倍稀釋標準品的過程：

1. 標記1-7號試管。

2. 向每支試管中加入120 µL EIA稀釋液。

3. 將120 µL人Nephrin標準品加入1號試管。

4. 通過吸放液體5次混合內容物。

5. 將120 µL從1號試管轉移到2號試管。

6. 按上述方法混合。

7. 繼續操作至7號試管。

8. 現在1-7號試管中含有代表2.0-0.0313 µg/ml人Nephrin的稀釋液。

文獻參考：

1. Putaala, H et al: The murine nephrin gene is specifically expressed in kidney, brain and pancreas: inactivation of the gene leads to massive proteinuria and death. Hum Mol Genet 10:1-8,2001

2. Putaala, H. et al: Primary structure of mouse and rat nephrin cDNA and structure and expression of the mouse gene. J Am Soc Nephrol 11:991-1001, 2000

3. Holtzman, LB et al: Nephrin localizes to the slit pore of the glomerular epithelial cell. Kidney Int 56:1481-1491, 1999

4. Routsalainen, V et al: Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proc Natl Acad Sci USA 96:7962-7967, 1999

5. Holthofer, H et al: Nephrin localizes at the podocyte filtration area and is characteristically spliced in the human kidney. Am J Pathol 155:1681-1687, 1999

6. Kestila, M et al: Positionally cloned gene for novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome.Mol Cell 1:575-582, 1998

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