Flipper-TR是一種熒光探針，能夠特異性靶向細胞的質(zhì)膜，并通過其熒光壽命的變化報告膜張力的變化。它是Flipper探針家族中先進的成員（參見文獻2和3），通過機械感受基團中兩個扭曲的二噻吩并噻吩之間的扭轉(zhuǎn)角度和偏振的變化來感知脂質(zhì)雙層膜的組織變化。Flipper-TR能夠自發(fā)地插入細胞的質(zhì)膜中，并且只有在插入脂質(zhì)膜時才會發(fā)出熒光。它具有寬吸收和發(fā)射光譜，通常可以用488 nm激光進行激發(fā)，而發(fā)射光則在575至625 nm之間收集。Flipper-TR適用于多種生物體，包括細菌、酵母、哺乳動物和植物。

艾美捷Flipper TR膜張力傳感器（CY-SC020）光物理特性：

- 吸收波長（λabs）：480 nm

- 發(fā)射波長（λem）：600 nm

- 大摩爾吸光系數(shù)（εmax）：1.66×10? mol?1·cm?1（DMSO中）

- 熒光壽命：2.8 - 7 ns

- 量子產(chǎn)率（QY）：30%（乙酸乙酯中）

Flipper TR膜張力傳感器的作用機制示意圖：

圖：左側為Flipper-TR分子的示意圖。中間為低張力脂質(zhì)雙層，其中Flipper呈扭曲狀態(tài)；右側為探針呈平面狀態(tài)。

儲存與操作：

收到后將探針儲存于-20°C。使用新鮮且無水的DMSO配制探針溶液（因為陳舊和含水的DMSO會顯著縮短探針的保質(zhì)期）。使用后將探針溶液儲存于-20°C。在打開前，應將小瓶恢復至室溫。如果儲存得當，溶液中的探針應可在3個月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意：DMSO溶液應特別小心處理，因為DMSO已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關的當?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

標記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的HeLa細胞優(yōu)化的，并已在其他常見細胞系中得到驗證。實驗協(xié)議的建議應作為起點，每種細胞類型的優(yōu)標記條件應通過實驗確定。

1. 配制1 mM儲備液：將Flipper-TR小瓶的內(nèi)容物溶解在50 µL無水DMSO中，制備1 mM儲備液。該溶液應儲存于-20°C或更低溫度。不要將溶液分裝成小份，因為它們會更快降解，且該化合物不會因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲存得當，該儲備液應可在三個月內(nèi)保持穩(wěn)定。（可選）如果需要準確測定儲備液的濃度，可將1 µL 1 mM儲備液稀釋在99 µL DMSO中。在425 nm處測量吸光度。使用上述給定的消光系數(shù)計算濃度。

2. 配制染色液：在應用于細胞之前，將Flipper-TR稀釋至所需濃度（從1 µM開始）的細胞培養(yǎng)基中（不要在使用前保存染色液超過2小時）。注意：當使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的細胞培養(yǎng)基時，與不含血清的培養(yǎng)基相比，標記效率可能會降低。如果觀察到信號較低，可以將探針濃度增加至2 µM。

3. 細胞準備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細胞。當細胞達到所需密度時，用染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細胞都被溶液覆蓋。將細胞置于37°C、含5% CO?的濕潤環(huán)境中孵育15分鐘，然后進行成像。30分鐘或更長時間后，由于膜的周轉(zhuǎn)，可能會觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構的標記。然而，其他含有膜的細胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體）的標記是有限的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構通常具有較短的壽命?？蛇x地，可以移除含有探針的培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞一次。由于探針僅在膜中具有熒光，因此不需要移除探針，特別是在計劃進行長期成像（>24小時）且培養(yǎng)基中含有血清的情況下。在低于1 µM的探針濃度下，與探針孵育2-3天后未觀察到對細胞活力的影響

4. FLIM成像：使用標準的FLIM顯微鏡對細胞進行成像，使用485 nm或488 nm脈沖激光進行激發(fā)，并通過600/50 nm帶通濾光片收集光子。我們建議優(yōu)化標記程序以及圖像采集設置，以盡量減少488 nm激發(fā)光對活樣本的光損傷。為了提取壽命信息，將感興趣區(qū)域（ROI）或單像素（積累足夠計數(shù)以確保良好統(tǒng)計）的光子直方圖擬合為雙指數(shù)，并提取兩個衰減時間τ?和τ?。具有較高擬合振幅的長壽命τ?用于報告膜張力，其值在2.8至7.0 ns之間。壽命越長，膜的張力越大。τ?的值較小（在0.5至2 ns之間），且擬合振幅較小，不太適合用于研究膜張力?？梢允褂脜⒖嘉墨I1中給出的校準程序?qū)勖c絕對膜張力相關聯(lián)。

重要注意事項：

- 只能通過FLIM顯微鏡進行膜張力測量，熒光強度或波長不能可靠地報告膜張力。

- 隨時間變化脂質(zhì)組成的系統(tǒng)也可能導致Flipper-TR壽命的變化。

- FLIM成像是一種高級顯微鏡技術，需要配備適當?shù)募ぐl(fā)激光器、光子計數(shù)系統(tǒng)和發(fā)射濾光片的商業(yè)或定制FLIM顯微鏡系統(tǒng)。建議客戶咨詢其儀器負責人或聯(lián)系顯微鏡制造商，以確保其系統(tǒng)能夠成像Flipper-TR的熒光和壽命。

文獻參考：

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.