確定細(xì)胞群體中絲狀肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）含量與游離球狀肌動(dòng)蛋白（G-肌動(dòng)蛋白）含量比例可靠且準(zhǔn)確的方法是通過西方印跡法定量分析F-肌動(dòng)蛋白和G-肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞分離組分（1-4）。通常的方法是將細(xì)胞在F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定緩沖液中勻漿，隨后通過離心分離F-肌動(dòng)蛋白與G-肌動(dòng)蛋白庫。然后通過SDS-PAGE分離各組分，并通過西方印跡法定量分析肌動(dòng)蛋白。最終結(jié)果提供了確定細(xì)胞骨架中整合的F-肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞質(zhì)中G-肌動(dòng)蛋白比例的最準(zhǔn)確方法。本試劑盒包含了進(jìn)行該檢測所需的所有試劑。

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒（#BK037）內(nèi)容：

試劑盒包含的材料足夠進(jìn)行30-100次檢測，具體取決于檢測設(shè)置，并包括用于陽性和陰性對(duì)照的試劑。包含以下組分：

裂解液和F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定緩沖液

ATP（貨號(hào)BSA04）

蛋白酶抑制劑混合物（貨號(hào)PIC02）

F-肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)對(duì)照溶液

F-肌動(dòng)蛋白解聚對(duì)照溶液

對(duì)照G-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（貨號(hào)AKL99）

抗肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（克隆7A8.2.1）（貨號(hào)AAN02-S）

SDS樣品緩沖液（5倍濃縮）

DMSO

詳細(xì)的操作手冊(cè)和廣泛的故障排除指南

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒用途包括：

研究藥物對(duì)G-肌動(dòng)蛋白與F-肌動(dòng)蛋白比例的影響。

研究突變細(xì)胞系與其親本細(xì)胞系在G-肌動(dòng)蛋白與F-肌動(dòng)蛋白比例變化方面的差異。

研究環(huán)境物理變化對(duì)G-肌動(dòng)蛋白與F-肌動(dòng)蛋白比例的影響。

所需設(shè)備：

能夠達(dá)到100,000×g的溫控離心機(jī)。理想情況下可接受100 µL樣本體積。雖然該檢測可以適應(yīng)更大體積，但這可能會(huì)導(dǎo)致每盒試劑的檢測次數(shù)減少（見第六部分：檢測協(xié)議）。

適合低毫升體積的小型勻漿器或25G針頭和注射器。

SDS-PAGE和西方印跡裝置及試劑，抗小鼠-HRP二抗

示例結(jié)果：

瑞士3T3細(xì)胞在DMEM/10% FBS中培養(yǎng)至50%融合度，溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%。細(xì)胞未處理（泳道1P和1S），或用0.1 µM的肌動(dòng)蛋白聚合藥物jasplakinolide處理30分鐘，溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%（泳道2P和2S）。細(xì)胞裂解后，處理成上清液（S）和沉淀（P）組分，并根據(jù)G-肌動(dòng)蛋白/F-肌動(dòng)蛋白體內(nèi)檢測試劑盒說明書通過西方印跡法定量分析肌動(dòng)蛋白。

圖1：在未處理的瑞士3T3細(xì)胞中，45%的肌動(dòng)蛋白為可溶性G-肌動(dòng)蛋白（1S），55%為不溶性F-肌動(dòng)蛋白（1P）。這與已發(fā)表的數(shù)據(jù)一致（3）。圖2：在用肌動(dòng)蛋白聚合藥物jasplakinolide處理的瑞士3T3細(xì)胞中，僅有5%的肌動(dòng)蛋白保留在可溶性G-肌動(dòng)蛋白組分（2S）中，而95%存在于不溶性F-肌動(dòng)蛋白沉淀組分（2P）中。泳道50、20和10分別代表50 ng、20 ng和10 ng的G-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。M代表分子量標(biāo)記（標(biāo)記的分子量顯示在印跡右側(cè)）。

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒文獻(xiàn)參考：

Milligan R.A. et al. 1990. Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites. Nature 348, 217-221.

Dos Remedios C.G. et al. 2003. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol. Rev. 83, 433-473.

Phillips D.R. et al. 1980. Identification of membrane proteins mediating the interaction of human platelets. J. Cell Biol. 86, 77-86.

Kim H.R. et al. 2008. Cytoskeletal remodeling in differentiated vascular smooth muscle is actin isoform dependent and stimulus dependent. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, C768-C778.