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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠附睪上皮采用膠原酶消化結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的大鼠附睪上皮經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

大鼠附睪上皮細胞分離自附睪組織；附睪（Epididymis）是一個由曲折、細小的管子構成的器官，一端接著輸精管（Ductusdeferens），一端接著睪丸（Testis）的曲細精管，具體結構主要包括輸出小管和附睪管。附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可分為頭、體、尾三部。精子離開睪丸后通過輸出小管進入附睪。附睪具有暫存精液并分泌附睪液營養精子的功能，以促進精子的進一步成熟附睪的功能是暫存精子，促進精子的進一步成熟。精子在附睪內獲得運動能力，總共停留8～17天，最終達到功能上的成熟。在這個過程中，精子除了自身的因素，還受到附睪微環境的影響，這包括了一系列的物理、化學變化和精子形態的改變。可以說，附睪微環境正常穩定是附睪發揮促成熟這一功能的必要條件。若附睪的功能發生異常，精子則不能成熟，引起不育。附睪上皮含有主細胞、基細胞、亮細胞等幾種類型細胞。基細胞，其頂部離附睪管腔有一定距離，在附睪各部分，其形態沒有差別，一般認為是貯備細胞；另一種主細胞，是維持附睪生理功能的物質基礎，在各區段的主細胞形態結構差別很大，這也反映出各區段的生理功能的差異。除上皮細胞外，附睪的管壁組織結構也有規律性的變化，附睪管起始段平滑肌有自發地節律性收縮，而尾部平滑肌就沒有這種特點，僅在射精一瞬間出現強烈的節律收縮。作為負責提供適合精子成熟微環境的附睪，具有活躍的分泌與吸收功能。其中，附睪上皮的電解質和水分的轉運，對保持附睪內合適的離子濃度和酸堿度，為精子成熟提供適宜的環境起著相當重要的作用。睪丸的支持細胞每天能產生大量睪網液，如一只公羊每天約能分泌40毫升睪網液，而從附睪排出的只不過幾百微升，也就是說睪丸分泌液有99%被附睪上皮重新吸收回體內。動物實驗表明，結扎輸精管時睪丸不會腫脹，但若結扎睪丸輸出小管，睪丸第二天就會腫脹，這就充分證實了附睪存在著強有力的吸收功能，但是重新吸收的意義尚不清楚。體外培養附睪上皮細胞對精子的發育、成熟，，附睪生理基礎功能研究具有重要意義。

培養信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠附睪上皮細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的優良培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

公司產品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。