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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的大鼠骨髓造血干采用沖洗骨髓、密度梯度離心、差速貼壁法結合培養基篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的大鼠骨髓造血干經CD34免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

大鼠骨髓造血干細胞分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨質間的網眼中，是一種海綿狀的組織，能產生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代，最后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。造血干細胞具有自我更新能力并能分化為各種血細胞的前提細胞，最終生成各種血細胞成分，包括紅細胞，白細胞和血小板。造血干細胞需要根據機體的生理需求適時的補充血液系統各個成熟細胞組分。同時在損傷、炎癥等應激狀態下，造血干細胞也扮演著調節和維持體內血液系統各個細胞組分的生理平衡的角色。臨床治療中，造血干細胞移植廣泛應用于血液系統疾病以及自身免疫疾病，在其它實體瘤的治療中，比如淋巴瘤，生殖細胞瘤，乳腺癌，小細胞肺癌，主要應用于常規治療失敗或復發難治以及具有不良預后因素的患者。造血干細胞以不對稱有絲分裂方式進行增殖，一個干細胞分裂產生兩個子細胞，一個分化為造血祖細胞，另一個則保持干細胞特征。造血干細胞在不斷體外培養產生大量造血祖細胞同時，保持自己既不增殖也不分化。體外培養微環境合適，造血干細胞可持續維持培養 60 天左右。 造血干細胞體外增殖培養需要基質細胞滋養（滋養層細胞），缺少滋養層細胞不增殖，無法長期培養，本產品為收集培養好的造血干懸浮細胞灌裝發貨，不包含滋養層，因此收貨后建議盡快實驗。

培養信息：

培養基：含FBS、EGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：懸浮

細胞形態：圓形

傳代特性：不建議傳代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠骨髓造血干細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的最佳培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

公司產品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。