兔脊髓微血管內皮原代細胞

兔脊髓微血管內皮細胞分離自脊髓組織；脊髓是細細的管束狀的結構，位于脊柱的椎管內且被脊椎保護；是源自腦的中樞系統延伸部分。中樞系統的細胞依靠復雜的聯系來處理傳遞信息。脊髓的主要功能是傳送腦與外周之間的信息。人和脊椎動物中樞系統的一部分，在椎管里面，上端連接延髓，兩旁發出成對的，分布到四肢、體壁和內臟。脊髓的內部有一個H形（蝴蝶型）灰質區，主要由細胞構成；在灰質區周圍為白質區，主要由有髓纖維組成；脊髓是許多簡單反射的中樞。脊髓兩旁發出許多成對的（稱為脊）分布到全身皮膚、肌肉和內臟器官。微血管又稱毛細血管。分布于各種組織和細胞間的微細的血管。介于微動脈和微靜脈之間。平均直徑7-9微米，數量極多，成網狀分布。管壁由一層內皮細胞及一薄層基膜組成，厚約0.5微米。基膜外面有薄層結締組織，其中有纖維細胞、巨噬細胞和周細胞等。細的毛細血管由一個內皮細胞圍成管腔，較粗的毛細血管由2-3個內皮細胞圍成。分布于肌肉組織、組織和結締組織中的毛細血管，內皮細胞間為縫隙連接（縫隙寬150埃），稱連續毛細血管；分布于內分泌腺、腎臟等處的毛細血管，除有縫隙連接外，細胞本身有許多小孔，（孔徑800-1000埃），稱有孔毛細血管；分布于肝、脾、骨髓及某些內分泌腺的毛細血管，管腔擴大，稱血竇。毛細血管的管壁薄、通透性大、管徑細（8-10微米）、數量多、血流速度慢，這些特點使其成為血液與組織液進行物質交換的場所，又稱交換血管。血竇（sinusoid）由毛細血管管腔擴大而成，竇壁的一般結構與毛細血管壁相同，由單層內皮細胞構成，內皮細胞膜上有窗孔。不同器官的竇壁結構各有差別。脾血竇的內皮細胞間有較寬裂隙；肝血竇內皮細胞是不連續的，有較寬的細胞隙（0.1-0.5微米）；肝、脾血竇的基膜不完整或無基膜，通透性比毛細血管大，較大的蛋白質和血細胞可以通過。肝血竇壁內有枯否細胞，脾血竇內外有巨噬細胞，這兩種細胞都有吞噬能力，可吞噬清除血液中的異物、細菌等有害物質，是機體單核巨噬細胞系統的重要組成分。某些內分泌腺的血竇有連續的基膜。

產品名稱：兔脊髓微血管內皮細胞

組織來源：

產品規格：5×10?Cells/T25培養瓶

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養基：含FBS、EGF、bFGF、IGF、VEGF、Heparin、Hydrocortisone、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：內皮細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔脊髓微血管內皮細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

方法簡介

實驗室分離的兔脊髓微血管內皮采用蛋白酶-膠原酶聯合消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔脊髓微血管內皮經CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于 37℃培 養箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養 瓶后加少量培養基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。