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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔皮脂腺采用蛋白酶聯合機械分離制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔皮脂腺經CK4免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

兔皮脂腺細胞分離自皮脂腺組織；皮脂腺是由腺泡與短的導管構成的全漿分泌腺，皮脂腺導管開口于毛囊。除手外的其余部位皮膚中均有皮脂腺，前額、鼻、背上部的皮脂腺多，稱為皮脂溢出部位。其余的部位比較少，掌、足趾及足背沒有皮脂腺。皮脂腺大多位于毛囊及立毛肌之間，由一個或幾個囊狀的腺泡與一個共同的短導管構成。分泌部呈囊泡狀，由多層腺細胞構成。腺泡周邊緊貼基膜的細胞較小，呈扁平或立方形，稱為基細胞。新生的腺細胞不斷向中心移動，體積增加，胞質內的小脂滴越來越多，腺泡中心的細胞更大，細胞核固縮、細胞器消失，胞質內充滿脂滴。后腺細胞解體并與脂滴同時排出，即為皮脂。皮脂腺的分泌因人種、年齡、性別及氣候等因素而不同。10歲以前分泌力弱，16～35歲分泌旺盛，老年期減弱；夏天分泌旺盛，秋冬季分泌較少；過食油膩、辛辣刺激的食物以及按摩也可增加分泌。皮脂腺分泌旺盛，可導致皮膚油膩、皮膚粗糙、毛孔粗大，容易發生粉刺及脂溢性皮炎。皮脂腺，分泌皮脂過少，可導致皮膚干燥、脫屑、皮膚老化等，所以控制皮脂腺的分泌很關鍵。皮脂腺的活動也與多種皮膚疾病相關，例如: 皮脂腺數量或其活動的減少可能會導致皮膚干燥綜合征，特應性皮炎是皮膚屏障功能障礙的炎癥性疾病，研究發現其發病與皮脂腺功能減弱有關 ，毛周角化病的皮損中則沒有皮脂腺。而皮脂分泌過多和尋常痤瘡相關。同時現有研究分析結構化數據特征， 嘗試探索皮脂腺與皮脂腺腫瘤發生的聯系。

培養信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基：基礎培養基，含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：上皮細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔皮脂腺細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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