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免疫熒光試劑盒檢測(cè)貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞操作指南
閱讀：1432 發(fā)布時(shí)間：2021-9-2細(xì)胞，生物學(xué)名詞。構(gòu)成生物體的基本單位。體形極微，在顯微鏡下始能窺見(jiàn)。形狀多種多樣。主要由細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成，表面有薄膜。動(dòng)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致相同。植物細(xì)胞質(zhì)膜外有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁中常有質(zhì)體，動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中常有中心體，而高等植物細(xì)胞中則無(wú)。細(xì)胞有運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)和繁殖等機(jī)能。
貼壁細(xì)胞：
1. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使約為50%-80%滿。
2. 按照特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞后，吸盡培養(yǎng)液，加入1 ml固定液，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4°C固定過(guò)夜)。
3. 去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
4. 用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。
5. 去除封閉液，用稀釋的特定一抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。為增強(qiáng)與一抗的結(jié)合，可以4°C孵育過(guò)夜。
6. 去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。每次洗滌時(shí)都可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。
7. 去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。
8. TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當(dāng)注意避光操作。
9. 復(fù)染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。
10. 滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細(xì)胞接觸封片液，切勿弄反。
11. 如果一抗選用適當(dāng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。
懸浮細(xì)胞：
A. 離心收集細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，吸除上清后輕輕彈散細(xì)胞。
B. 加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4°C過(guò)夜)。
C. 離心去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘。洗滌期間可以用手或搖床輕輕晃動(dòng)。
D. 最后一次離心后吸去大部分液體保留約50 μL液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。
E. 稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。如果條件許可，可以使用適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)，通過(guò)離心把細(xì)胞貼緊在載玻片上。
F. 用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘。
G. 去封閉液，用稀釋的特定一抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。為增強(qiáng)與一抗的結(jié)合，可以4°C孵育過(guò)夜。
H. 去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。
I. 去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。
J. TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當(dāng)注意避光操作。
K. 復(fù)染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。
L. 滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡。
M. 如果一抗選用適當(dāng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。