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靈芝酸DM173075-45-1標準品/對照品采用細胞培養(yǎng)和T-A克隆技術,在輪狀病毒主要結構蛋白VP7基因序列上設計合成引物,經PCR擴增后將特異性產物連接入pGEM-T-easy載體中,經過酶切鑒定和測序分析獲得輪狀病毒cDNA標準品.  利用常規(guī)PCR和實時定量PCR方法對所獲得的cDNA標準品進行特異性、穩(wěn)定性和重復性指標的檢驗.

結果表明,利用此標準品制備的標準曲線具有較高的擴增效率和良好的線性關系(斜率為-3.353,R2=0.995);實時定量PCR熔解曲線分析表明,溫度在81℃±0.5℃的PCR產物是輪狀病毒VP7序列上的特異性產物,表明此標準品是輪狀病毒特異性的;

同時,所制備的標準品在實時定量PCR檢測中具有較大的線性范圍(9×100~9×1011copies/μL,每個反應低可以檢測到9個拷貝數的輪狀病毒cDNA,表明利用該標準品進行實時定量PCR分析時具有較高的檢測靈敏性;

此外,該標準品具有較高的穩(wěn)定性和重復性(3次獨立實驗CV值在0.2%~0.9%之間),可長期穩(wěn)定保存.構建的標準品可用作檢測水環(huán)境中輪狀病毒的實時熒光定量PCR的外標準品.

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