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兔食管平滑肌細胞

培養基：原代平滑肌細胞培養體系

傳代特性：根據細胞特性

消化液：0.25%胰dan白酶

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞簡介：食管可分為頸段、胸段和腹段。脊椎動物食管的頸段位于氣管背后和脊柱前端，胸段位于左、右肺之間的縱膈內，胸段通過膈孔與腹腔內腹相連，腹段很短與胃相連。哺乳動物的食管結構上由內向外分四層：黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜。其中，肌層，上1/3段為骨骼肌，下1/3為平滑肌，中段為骨骼肌和平滑肌混合組成。其肌纖維的排列為內環形和外縱形兩層。

食管還有括約肌，位于人環狀軟骨水平的,稱為食管上括約肌;位于食管下端,一部分在膈上，穿過膈孔，另一部分在膈下的高壓帶，稱為食管下括約肌。

食管平滑肌瘤是起源于食管平滑肌的良性腫瘤，發生部位多見于食管中段，其次為下段，頸段罕見。臨床上大多數病變發生在壁間，其余可在腔內，外膜下及少數呈彌漫型，使食管肌層呈廣泛瘤樣增生。
一、細胞基本屬性

原代細胞分離培養的思路：

取材--分離--培養--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養基中培養，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含素的混合培養基，隨后隔天換液。

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注意事項：

1. 培養基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和技術部溝通；由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。