1. 概要

嘔吐毒素也稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），是由串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌以及多育鐮刀菌等產生的真菌毒素，大多存在于糧谷、飼料及其制品中。中毒后影響消化系統和神經系統，主要表現為惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等癥狀。我國標準規定：玉米、大麥、小麥及其制品中嘔吐毒素不得超過1mg/kg，豬、犢牛、泌乳期動物配合飼料中嘔吐毒素不得超過1mg/kg，牛、家禽配合飼料中嘔吐毒素不得超過5mg/kg。

1. 原理

測定的基礎是抗原-抗體反應。微孔板上包被有抗抗體。加入嘔吐毒素（DON）標準品或樣品、酶標抗原和抗體后，游離的嘔吐毒素與酶標抗原競爭結合抗體，抗體或抗體結合物與固定在微孔板上的抗抗體再結合，沒有結合的標準品、酶標抗原及抗體被洗去，加入TMB底物顯藍色，加入終止液后顏色由藍變黃，用酶標儀在450nm處檢測，吸光值與樣品中嘔吐毒素含量成負相關，與標準曲線比較即可得出嘔吐毒素的含量。

1. 試劑盒的組成

1. 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）

1. DON標準品：0ng/mL 、10ng/mL、

40ng/mL、100ng/mL、250ng/mL 1 瓶 × 1.0mL

1. DON抗體：              1 瓶 × 10mL
2. DON酶標抗原：           1 瓶 × 10mL
3. 10× 濃縮洗滌液：         1 瓶 × 50mL
4. DON稀釋緩沖液A：        1 瓶 × 50mL
5. DON稀釋緩沖液B：        1 瓶 × 50mL
6. 顯色底物TMB：           1 瓶 × 17mL
7. 終止液：                 1 瓶 × 7mL
8. 試劑盒說明書：           1份
9. 質檢報告：               1份

1. 需要的儀器、試劑

1. 儀器   

1. 酶標儀 450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）
2. 微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
3. 多功能旋轉混合器（或者搖床、高速均質器）
4. 酶標板振蕩器
5. 渦旋混合器
6. 離心機
7. 50mL離心管
8. 1.5mL離心管
9. 定性濾紙
10. 過濾漏斗
11. 天平：感量0.01g

1. 試劑

1. 純水（蒸餾水、去離子水）

1. 樣品處理

5.1谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質器均質3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過濾，吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入400μL DON稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：25

5.2飼料（高靈敏度）：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質器均質3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過濾，測pH值，如果不在pH6-8范圍內，請用酸或堿，進行調整。
3. 吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入400uL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：25

5.3飼料：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質器均質3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過濾，測pH值，如果不在pH6-8范圍內，請用酸或堿，進行調整。
3. 吸取50μL濾液置于1.5mL離心管中，加入450uL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：50

5.4發酵液：

1. 吸取40μL液體樣品置于1.5mL離心管中
2. 加入960μL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：25

5.5尿液樣品：

1. 取5mL待檢樣品于15mL離心管中，3000r/min，離心10分鐘
2. 吸取100μL離心后澄清樣品置于1.5mL離心管中
3. 加入400μL DON稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數：5

6． 酶聯免疫分析程序

6.1測定之前注意事項

1. 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2. 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有溫育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。

6.2溶液的配制

1. 提取液的配制:純水（或蒸餾水、去離子水）。
2. 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測）。

6.3測定程序

1. 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2. 吸取50μL 標準品或樣品分別加至相應的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL的DON酶標抗原、50μL的DON抗體，加蓋，在室溫溫育30分鐘（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。
3. 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液，置于酶標板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復操作四次。洗完后用力在吸水紙上拍干。
4. 每孔加入150μL底物，室溫避光溫育10分鐘。
5. 每孔加入50μL 終止液。
6. 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7.  結果判定

1. 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以DI一個標準（0標準）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以*，即百分吸光度值。

以嘔吐毒素標準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。

1. 樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應的稀釋倍數。
2. 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用純水進行稀釋。

8.  注意事項

1. 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導致數值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現板孔干燥過久的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。
3. 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。
5. 終止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結果不準確。
7. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9.  試劑盒的性能指標

1. 檢測限LOD: 谷物0.15ppm（mg/kg），飼料0.25ppm（mg/kg），發酵液0.15ppm（mg/kg）,尿液0.05ppm（mg/kg）。（LOD：空白樣品測定值+2倍標準偏差SD）
2. 定量限LOQ: 谷物0.25ppm（mg/kg），飼料0.5ppm（mg/kg），發酵液0.25ppm（mg/kg）,尿液0.1ppm（mg/kg）。
3. 定量檢測范圍：谷物0.25-6.0ppm，飼料0.5-12.0ppm，發酵液0.25-6.0ppm,尿液0.1-1.0ppm。