WinSera無(wú)外泌體血清的常見問題？

能不能用無(wú)血清培液養(yǎng)，能不能用正常培液養(yǎng)到70%換無(wú)外泌體血清的培液？

有些paper確實(shí)會(huì)使用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞然后收上清分離外泌體，論壇中也有已經(jīng)發(fā)表文章的朋友使用該方法，該方法是使用含有外泌體的血清培養(yǎng)細(xì)胞到一定密度，然后吸去培液，PBS洗數(shù)次之后換無(wú)血清培液進(jìn)行培養(yǎng)即可。但是目前很多高檔次的paper基本都是使用含無(wú)外泌體血清的培液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的，無(wú)外泌體血清可以按照之前hzangs的推文介紹的方法制備。   如果你的無(wú)外泌體血清比較珍貴，也可以考慮先將細(xì)胞使用有外泌體血清培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)到一個(gè)合適的密度如70%-80%左右時(shí)，吸去培液，37℃預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞3-5遍，換無(wú)外泌體血清的培液即可。

那種分離方法好？

使用何種方法進(jìn)行外泌體的分離是一個(gè)比較復(fù)雜的問題。這個(gè)問題涉及到你計(jì)劃的下游實(shí)驗(yàn)是什么。通常來(lái)說(shuō)下游實(shí)驗(yàn)涉及RNA的，對(duì)外泌體純度要求可能不高，但是如果下游研究設(shè)計(jì)蛋白，那么對(duì)外泌體的純度要求還是比較高的。在此列出常見分離方法的一些優(yōu)缺點(diǎn)供大家根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇。超速離心法：操作繁瑣，技術(shù)難度高，耗時(shí)長(zhǎng)，分離外泌體純度較高，目前分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)；聚合物沉淀法：操作簡(jiǎn)便，技術(shù)難度低，耗時(shí)短，分離外泌體純度低，可能被reviewer質(zhì)疑；膜親和法：操作簡(jiǎn)便，適用于RNA實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)短，技術(shù)難度低，分離外泌體的純度尚可接受；凝膠排阻法：操作相對(duì)簡(jiǎn)單，技術(shù)難度略高，分離外泌體純度高，但很難保證無(wú)菌；抗體親和沉淀法：操作簡(jiǎn)單，純度尚可，但是抗體很貴并且抗體不可回收利用。

用哪個(gè)marker做WB好？常用的是CD63、CD81等等，

 外泌體蛋白做WB用什么內(nèi)參基因？

外泌體做WB的內(nèi)參基因一直存在爭(zhēng)議。但是按照David Lyden曾發(fā)表于CNS的paper，actin和GAPDH 都可以的。

用多少培液收外泌體？

培液使用量取決于細(xì)胞系。有些細(xì)胞系外泌體釋放量高，幾毫升即可；有些釋放量低，需要上百毫升。一般來(lái)說(shuō)一個(gè)普通的細(xì)胞系，用超離分離外泌體，第一次摸索條件，起始培液量最好50ml以上。