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RNA pull down

實驗原理

RNA pull down是體外研究RNA與蛋白互作的重要技術(shù)。該技術(shù)是用生物素標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄的靶RNA分子，再用鏈霉親和素純化出與靶RNA結(jié)合的蛋白復(fù)合體，洗脫得到RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。再通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與靶RNA結(jié)合；或通過質(zhì)譜儀檢測可以篩選出與靶RNA結(jié)合的蛋白。

生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用；其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。因此用生物素標(biāo)記核酸后，可以純化出與該核酸結(jié)合的各種生物大分子復(fù)合物。

實驗流程

1. 探針設(shè)計及標(biāo)記：體外轉(zhuǎn)錄或合成獲取RNA，生物素標(biāo)記;

2. pull down：與細胞裂解液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，從而把靶RNA結(jié)合蛋白從細胞裂解液中分離出來，經(jīng)過洗滌將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除；最后，洗脫得到與靶RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物；

3. 互作蛋白質(zhì)鑒定：再經(jīng)過Western Blot（WB）或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。

服務(wù)內(nèi)容

1. 體外轉(zhuǎn)錄或合成RNA，生物素標(biāo)記；

2. 細胞培養(yǎng)與細胞裂解液制備；

3. pull down捕獲互作蛋白；

4. Western blot驗證互作蛋白；

5. MS篩選鑒定互作蛋白。

交付結(jié)果

1. 提供完整的實驗報告；

2. 客觀公正的原始數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果分析。

更多實驗技術(shù)

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原代細胞分離與培養(yǎng)

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