丙酮酸（pyruvic acid PA）含量測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。
測定原理：
丙酮酸與2,4-er硝ji苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙，在堿性溶液中呈顯色。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體2.5mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體12.5mL×1瓶， 4℃保存。
丙酮酸提取：
1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），靜置30min， 8000g，25℃離心10min，取上清待測。
2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，25℃離心10min，取上清待測。
3、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），進行冰浴勻漿，靜置30min， 8000g，25℃離心10min，取上清待測。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至520nm，蒸餾水調零。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL樣本和25μL試劑一，混勻，靜置2min，加入125μL試劑二，混勻，于520nm波長處測定管吸光值A。
丙酮酸含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675； x為丙酮酸含量（µg/mL），y為吸光值。
2、按照血清（漿）體積計算
丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)
3、按照蛋白濃度計算
丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照樣品質量計算
丙酮酸含量（µg/g鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W
3、按照細菌或細胞密度計算
丙酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)
V1：加入反應體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0233x + 0.0675； x為丙酮酸含量（µg/mL），y為吸光值。
2、按照血清（漿）體積計算
丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（V3×V1÷V2）=429.2×(A-0.0675)
3、按照蛋白濃度計算
丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照樣品質量計算
丙酮酸含量（µg/g鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2）=42.92×(A-0.0675) ÷W
3、按照細菌或細胞密度計算
丙酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（500×V1÷V2）=0.086×(A-0.0675)
V1：加入反應體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。
注意：Z低檢測限為1μg/mL或1μg/g鮮重或10ng/mg prot
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