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1.    產品介紹

HA 標簽是人流感血凝素的第 98-106 氨基酸序列YPYDVPDYA，對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N 端或者 C 端，因此常被用于重組蛋白的融合表達。Anti-HA Affinity Beads 4FF 以高度交聯的 4%瓊脂糖凝膠為基質，雜蛋白非特異性結合少， 可用于 HA 標簽融合蛋白的純化和免疫沉淀（IP）。

表 1. Anti-HA Affinity Beads 4FF 產品性能

1.    試劑準備

1.1  緩沖液的準備

所用水和緩沖液在使用之前建議用 0.22μm 或 0.45 μm 濾膜過濾。平衡液: 10mM Tris,0.15M NaCl, pH7.4

洗雜液：10mM Tris,0.15M NaCl, 0.05% Tween-20,pH7.4

化學洗脫液: 0.1M glycine HCl, pH2.0-2.8，3M NaSCN 或者 50mM NaOH

溫和洗脫液：50mM Tris,0.15M NaCl, 100-500ug HA 多肽/ml ，pH7.4 中和液：1M Tris-HCl，pH8.5

1.2   樣品準備

上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強度和 pH 值，可以用平衡液對樣品或細胞培養液稀釋，或者用平衡液透析。

樣品在上樣前建議離心或用 0.22μm 或 0.45μm 濾膜過濾，減少雜質，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

2.   樣品純化

2.1   柱層析

1) 將Anti- HA Beads 4FF 裝入合適的層析柱，層析用 5 倍柱體積的平衡液進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下。

2) 將樣品加到平衡好的Anti-HA Affinity Beads 4FF 中，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率。

3)   用 10-20 倍柱體積的洗雜液進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4) A 化學洗脫：使用 5 倍柱體積的洗脫液，如果是甘氨酸溶液洗脫，收集管中預先加好中和液 10-20µl 中和液/ml 洗脫液，分管收集。

注：酸性洗脫后填料要立即用平衡液平衡，Anti-HA Affinity Beads 4FF 在洗脫液中不要超過 20min。

B 溫和洗脫：使用 5 倍柱體積的競爭性洗脫液 HA 多肽 1mg/ml 洗脫。30 度孵育 10-15min。重復 1-2 次。

5)   使用 3 倍柱體積的洗脫液再生，然后用平衡液平衡至中性

6) 使用 5-10 倍柱體積的含有 0.05%疊氮-化鈉的 TBS 清洗。然后保存在含有 0.05%疊氮-化鈉的 TBS 溶液中，2-8 度保存。

2.2   靜態吸附

1)   填料準備：取適量的Anti-HA Affinity Beads 4FF 加入層析柱中，流干保護液。加入 5

倍柱體積的平衡液清洗。

2)   加入樣品溶液，4 度或室溫震蕩孵育 30min(不能磁力攪拌)，確保填料與樣品溶液充分混合。

3)   孵育完畢后，將填料混合液離心（1000x g 離心 5min）或過濾收集填料。

4)   將填料裝入層析柱中，用平衡液清洗直至紫外穩定。

5)   用洗脫液或競爭性洗脫液洗脫，參考 3.1  中 4）。

6)   填料再生和保存參考 3.1 中 5)和 6)。

2.3   免疫共沉淀操作流程

1)   填料準備： 取 20-100µl 的 Anti-HA Affinity Beads 4FF 混合液加入到 2ml 離心管中，

5000Xg 離心 30 秒，吸棄上清。

2) 填料加入 0.5ml 平衡液，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用），5000Xg 離心 30 秒，吸棄上清。重復一次。

3) 加入 200-1000µl 樣品裂解液到處理好的填料中，混合均勻，在室溫下置于翻轉混合儀輕輕翻轉離心管， 促使樣品和填料充分接觸并吸附，室溫至少 1 小時。5000Xg 離心 30 秒，吸取上清，留樣檢測。

4) 洗雜：加入 0.5ml 的洗雜液，懸浮填料，進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，5000Xg 離心 30 秒。再重復三次。確保去除非特異性吸附。

5)   樣品洗脫：可根據后期檢測的需要選擇不同的洗脫方法。

A:化學洗脫

加入 100µl 的洗脫液（0.1M glycine HCl, pH2.0-2.8，3M NaSCN 或者 50mM NaOH），懸浮填料，室溫孵育 5min。5000Xg 離心 30 秒。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脫樣品放置 4 度，長時間放置-20 度保存。

B:溫和洗脫

加入 100µl 競爭性洗脫液 HA 多肽洗脫液。30 度孵育 30min, 5000Xg 離心 30 秒。小心取出上清，不要吸到填料，重復洗脫 1-2 次。洗脫樣品放置 4 度，長時間放置-20 度保存。C:SDS-PAGE Buffer 洗脫

樣品緩沖液中含有β-巰基乙醇和 DTT,可以使填料中抗體重鏈和輕鏈斷開。含有 SDS 的樣品緩沖液可以使Anti-HA 抗體變性，洗脫后的 Anti-HA Affinity Beads 4FF 沒辦法重復使用。每管中加入 20µl 2X 樣品緩沖液，煮 3min。5000Xg 離心 30 秒，吸取上清 SDS-PAGE 電泳檢測。

問題及解決方案