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【產品名稱】
通用名稱：EB 病毒(EBV)核酸擴增檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：Epstein-Barr Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
EB 病毒（Epstein-Barr Virus, EBV），又稱人類皰疹病毒 4 型（Human herpes virus 4，HHV-4），是 1964 年 Epstein 和 Barr 在研究非洲兒童淋巴瘤（BL）時，從瘤細胞培養發現的一種病毒，是傳染性單核細胞增多癥的病原，并與 BL 和鼻咽癌有關。EBV 流行廣泛，80-90%成人發生過 EBV 感染。幼兒感染后多數無明顯癥狀，或引起輕度咽炎和上呼吸道感染，約有 50%出現傳染性單核細胞增多癥。病毒主要通過唾液傳播，也可因輸血傳染。感染后EBV 可能現在口咽部上皮細胞增殖，然后病毒感染局部黏膜的 B 細胞，這些細胞進入血液循環而造成全身性 EBV 感染[1-2]。
本試劑盒適用于檢測血清等樣本中的 EB 病毒，用于 EB 病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒根據 EB 病毒基因設計特異性的引物和探針[2-3]，用熒光 PCR 技術對 EB 病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
EBV 反應液 | 500μl×2 管 |
EBV 陽性質控品 | 50μL×1 管 |
陰性質控品 | 250μL×1 管 |
注：
1） 不同批號試劑不能混用。
2） 試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
2000rpm 離心 5min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中
1.2 DNA 提取
1) DNA 的提取也可以采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | EBV 反應液 | 酶液 |
用量（樣本數為 N） | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38， 且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質控標準
陰性質控品：Ct 值>38 或無 Ct 值；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定 量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通 則》進行處理。
【參考文獻】
[1] Himmelfrb J, Hakim BM. Biocompatibility and risk of infection in hemo- dialysis patient [J]. Nephrol Dial Transplant, 1994, 9(1): 134-144
[1] 黎慶梅, 陳輝, 莊碧英. 實時熒光定量PCR 在EB 病毒DNA 檢測中的應用[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2011.
[2] 曾剛毅, 唐孝亮, 鐘海-軍. 實時熒光定量PCR 法檢測鼻咽癌患者血漿游離EB 病毒 DNA 的臨床應用[S]. 檢驗醫學與臨床, 2008.
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