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Q 熱立克次體（CB）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）

通用名稱：Q 熱立克次體（CB）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name ：Coxiella burnetii Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

Q 熱是全-世界分布的人獸共患病，其病原體貝氏柯克斯體( Coxiella burnetii ,俗稱 Q 熱立克次體)  是一種急性細胞內(nèi)寄生菌[1]。目前, Q 熱立克次體的臨床診斷主要依靠血清學(xué)檢測,但是由于特異性抗體出現(xiàn)較晚,故無法在早期對該病進行診斷。細菌培養(yǎng)分離方法操作復(fù)雜和耗時，而且成功率不高。普通 PCR 法顯得不敏感，加上 PCR 法的其它缺陷,使得 Q 熱立克次體的PCR 檢測難以在臨床上推廣使用。實時熒光定量 PCR 是一種快速檢測病原體的高特異和高敏感技術(shù)。

本試劑盒利用實時熒光定量 PCR 原理，定性檢測 Q 熱立克次體，對 Q 熱立克次體的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，針對Q 熱立克次體基因高度保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物和探針，利用相應(yīng)儀器對 PCR 過程進行實時監(jiān)測，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量PCR 檢測儀。

【標本采集】

適用于人體的血液、體液和棉拭子等多種樣本。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

血液、體液和棉拭子樣本取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸-提取或純化-試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操作。

2.  試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline 和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無 Ct 值；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] Go M F, Smoot DT. Helicobacter pylori, gastric MALT lymphoma, and adenocarcinoma of the stomach [J]. Seminars in Gastrointestinal Disease, 2000, 11( 3): 134-141.