摘要：伯氏瘧原蟲作為瘧疾研究的重要模式生物，其基因操作技術對深入探究瘧原蟲生物學特性、致病機制及抗瘧藥物研發至關重要。電穿孔轉染是將外源核酸導入瘧原蟲的常用方法，但現有方案仍存在轉染效率不穩定、細胞損傷較大等局限。本文聚焦于對伯氏瘧原蟲電穿孔轉染方案的優化，通過系統地調整電穿孔參數、優化轉染試劑配方、改進瘧原蟲預處理方式以及完善轉染后培養條件，顯著提升了轉染效率，降低了瘧原蟲死亡率，為瘧原蟲基因功能研究提供了更穩健、高效的技術手段，有望助力瘧疾領域科研工作取得更多突破性進展。
瘧疾是全球嚴重的公共衛生問題，每年導致數百萬人口患病、數十萬人死亡，嚴重威脅人類健康，尤其在熱帶和亞熱帶地區肆虐。伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei）因易于在實驗室小鼠模型中傳代培養、生命周期相對清晰明確，成為瘧原蟲研究領域的經典模式生物，為理解瘧原蟲基本生物學過程、致病機理以及篩選潛在抗瘧藥物靶點等工作提供了關鍵支撐。
基因轉染技術能人為地將外源基因或核酸片段導入瘧原蟲，借此干擾或補充其固有基因功能，是揭示瘧原蟲基因作用、解析復雜信號通路的 “金鑰匙"。電穿孔轉染基于高壓電脈沖短暫破壞細胞膜磷脂雙分子層結構，形成可逆性納米級孔隙，促使外源核酸順勢進入細胞內部。然而，傳統伯氏瘧原蟲電穿孔轉染方案面臨諸多困境，諸如轉染效率在不同批次實驗間波動明顯，過高電壓易引發瘧原蟲不可逆損傷、活力銳減，轉染后瘧原蟲生長恢復緩慢等，這些問題猶如絆腳石，限制了對瘧原蟲深入細致的遺傳學剖析。因此，對電穿孔轉染方案開展進階優化，具有迫切且重要的現實意義，有望突破現有技術瓶頸，為瘧原蟲研究注入全新活力。
瘧原蟲株與宿主動物：采用實驗室長期穩定傳代培養的伯氏瘧原蟲 ANKA 株，以 6 - 8 周齡雌性 BALB/c 小鼠為寄生宿主，通過腹腔注射感染瘧原蟲，待小鼠原蟲血癥達到適宜水平（5% - 10%）時，采集血液分離瘧原蟲用于后續實驗。
主要試劑：RPMI 1640 完整培養基（添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素混合液、0.5% 次黃嘌呤），作為瘧原蟲基礎培養介質；電轉染緩沖液（選用商業化低離子強度、含特定濃度蔗糖與甘露醇的緩沖體系，經預實驗驗證對瘧原蟲滲透壓平衡維護效果良好）；外源轉染質粒（攜帶綠色熒光蛋白基因 GFP，作為轉染成功可視化標記，構建骨架基于瘧原蟲偏好密碼子優化、具備高效啟動子驅動）；核酸染劑（如 SYBR Green I，用于評估轉染后瘧原蟲核酸含量與完整性）；臺盼藍，區分活死瘧原蟲以計算存活率。
儀器設備：電穿孔儀（具備精確電壓、電容、電阻調控功能，可預設多種脈沖程序），血細胞計數板，離心機（可適配微量離心管，具備制冷功能保障樣品穩定性），熒光顯微鏡（裝備高分辨率成像系統、適配 GFP 激發與發射濾光片）。
瘧原蟲預處理：從感染小鼠心臟采血，抗凝處理后低速離心（500g，5min）分離紅細胞層，用預冷的不完整 RPMI 1640 培養基溫和洗滌 3 次，去除血漿成分及宿主免疫細胞殘留。隨后將瘧原蟲感染紅細胞（pRBCs）重懸于電轉染緩沖液，調整瘧原蟲密度至 1×10?個 /mL，并添加適量蛋白酶抑制劑混合物，冰浴孵育 30min，適度抑制瘧原蟲表面膜蛋白過度活躍，降低電穿孔對細胞膜結構的額外破壞風險。
電穿孔轉染操作：將預處理后的 pRBCs 與外源質粒 DNA（按 10:1 質量比，經預優化比例設定）輕柔混合，轉移至預冷的電穿孔 cuvette（0.2cm 電極間距，確保電場均勻分布），迅速置于電穿孔儀樣品槽內。設置電壓梯度范圍（從 200V - 400V，以 50V 步長遞增）、電容固定為 25μF、電阻 500Ω，給予單次方形電脈沖刺激，脈沖時長控制在 5 - 10ms，操作全程在冰浴環境下執行，減少熱效應引發的瘧原蟲損傷。
轉染后培養復蘇：電穿孔結束后，立即將樣品轉移至含預熱 RPMI 1640 完整培養基的離心管，輕柔混勻，低速離心（300g，3min）去除電轉染緩沖液殘留，重懸沉淀后轉接至細胞培養板，置于 37°C、5% CO?飽和濕度培養箱孵育。培養初期 6 - 8h，添加適量抗氧化劑（如谷胱甘肽）與細胞膜修復促進劑（膽固醇 - 磷脂復合物），助力瘧原蟲細胞膜修復、緩解氧化應激損傷，每隔 2h 取樣，用熒光顯微鏡監測 GFP 表達情況、臺盼藍染色統計瘧原蟲存活率。
通過對不同電壓參數下轉染后瘧原蟲 GFP 陽性率統計分析發現，當電壓設置在 300V 時，轉染后 24h GFP 陽性瘧原蟲占比達峰值（約 35%），相較于基礎方案（200V 下僅 15% 左右）提升顯著。在低電壓區間（200V - 250V），因電脈沖能量不足，孔隙形成效率低，外源 DNA 進入受阻；而高電壓（350V - 400V）雖孔隙增多，但對瘧原蟲損傷嚴重，存活瘧原蟲銳減且部分細胞膜修復失敗，難以穩定表達外源基因，致使轉染效率不升反降，表明適度電壓對平衡轉染效果與瘧原蟲生存至關重要。
臺盼藍染色結果顯示，經優化預處理及轉染后培養條件，瘧原蟲在轉染后 6h 存活率從傳統方案的不足 60% 提升至 80% 以上，且后續 24h 內維持相對穩定，細胞活力增強為外源基因有效整合、表達提供良好細胞內環境。冰浴孵育與添加保護劑有效緩沖電脈沖沖擊、減輕氧化損傷，避免瘧原蟲因應激死亡，保障了轉染操作后瘧原蟲群體規模與活性狀態。
重復實驗批次（n = 5）數據表明，優化方案轉染效率標準差控制在 3% 以內，瘧原蟲存活率波動范圍小于 5%，相較于傳統方案（轉染效率標準差達 8%，存活率波動超 10%）穩定性大幅提升，彰顯新方案可靠、可重復性強，為不同實驗室開展瘧原蟲基因研究奠定堅實方法基礎，減少因實驗技術差異導致的數據偏差與結論分歧。
本優化方案精準把控電穿孔關鍵參數、協同改良預處理與培養環節，實現轉染效率與瘧原蟲存活率 “雙升"，攻克傳統方法效率低、不穩定、損傷大 “頑疾"。對電壓精細調校契合瘧原蟲細胞膜電學特性，保護劑運用契合細胞應激修復生理需求，各環節相輔相成、絲絲入扣，形成高效、穩健轉染體系。
在基礎科研層面，助力深度解析伯氏瘧原蟲基因功能，通過定點突變、基因敲除 / 敲入等遺傳操作，繪制精細基因調控網絡，闡釋發育、侵染宿主等生命進程分子機制；在藥物研發領域，方便構建抗性篩選模型、評價新藥靶點有效性，加速抗瘧藥物從實驗室到臨床轉化進程，為全球瘧疾防控事業添磚加瓦，開拓瘧原蟲研究新天地。
本文針對伯氏瘧原蟲電穿孔轉染方案系統優化，經嚴謹實驗驗證，在轉染效率、瘧原蟲存活及穩定性多維度成效斐然，為瘧原蟲基因操作開辟新徑。后續研究可聚焦于拓展適配不同瘧原蟲株與外源核酸類型，持續深挖技術潛能，憑借更精良基因工具，深挖瘧原蟲秘密，向著攻克瘧疾目標穩步邁進。
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