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一、引言

1. 基因轉(zhuǎn)染于現(xiàn)代生物學(xué)研究意義重大，是實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)爰?xì)胞、探究基因功能及調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究里，合適轉(zhuǎn)染方法關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗。脂質(zhì)體法與電穿孔法因具相對(duì)高效性備受矚目，但各有優(yōu)劣，學(xué)界持續(xù)探尋其優(yōu)化應(yīng)用，為本研究提供探索空間。

2. 脂質(zhì)體法借脂質(zhì)體包裹 DNA 等核酸物質(zhì)，經(jīng)膜融合或內(nèi)吞入細(xì)胞；電穿孔法則利用電脈沖瞬間穿孔細(xì)胞膜，促核酸進(jìn)入。過(guò)往研究對(duì)二者機(jī)制闡述漸豐，但在不同細(xì)胞系、基因類(lèi)型下精準(zhǔn)轉(zhuǎn)染參數(shù)及適用性仍存模糊。

二、材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞系：選用常見(jiàn)的 HEK293、HeLa 及 CHO 細(xì)胞系，分別代表腎上皮、宮頸癌細(xì)胞及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，源于 ATCC 保藏中心，培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，37°C、5% CO?孵育箱維持生長(zhǎng)，定期傳代確?；钚?。

2. 主要試劑：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑選 Lipofectamine 2000，依說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存；電穿孔緩沖液為自制蔗糖溶液（272 mM 蔗糖、7 mM 磷酸鈉、1 mM MgCl?，pH 7.4）；報(bào)告基因質(zhì)粒 pEGFP-N1（含 GFP 編碼序列）用于直觀(guān)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤，大提后 -20°C 保存。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1. 電穿孔儀：選用 Bio-Rad Gene Pulser Xcell，可精準(zhǔn)調(diào)控電脈沖參數(shù)，電壓范圍 100 - 2500 V，電容 25 - 3275 μF，電阻 20 - 4000 Ω，配備 0.4 cm 電擊杯，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)校準(zhǔn)確保脈沖輸出穩(wěn)定。

2. 熒光顯微鏡：Nikon Eclipse Ti2，具高分辨率 CCD 相機(jī)，激發(fā)光波長(zhǎng)適配 GFP 檢測(cè)（488 nm），能精確捕捉細(xì)胞熒光信號(hào)，用于轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 GFP 表達(dá)成像；流式細(xì)胞儀 BD FACSCanto II，可定量分析 GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例，激光激發(fā)光源及熒光檢測(cè)通道優(yōu)化，保證檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確性。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染

1. 細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前 24 h，胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按 5×10?個(gè) / 孔接種于 24 孔板，每孔含 500 μL 新鮮培養(yǎng)基，保證細(xì)胞貼壁均勻、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，置孵育箱過(guò)夜平衡。

2. 轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：取兩支無(wú)菌離心管，A 管加 50 μL Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基，稀釋 1 μg 質(zhì)粒 DNA，輕柔混勻；B 管加 50 μL Opti-MEM，加入適量 Lipofectamine 2000（依說(shuō)明書(shū)按 DNA 量對(duì)應(yīng)比例），輕彈管壁混合，室溫孵育 5 min；后將 A 管 DNA 液緩慢滴入 B 管，邊滴加邊輕搖，室溫靜置 20 min 形成復(fù)合物。

3. 轉(zhuǎn)染操作：棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，用 PBS 輕柔漂洗 2 次，每孔加入 200 μL 含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的 Opti-MEM，輕晃混勻，放回孵育箱，37°C、5% CO?孵育 4 - 6 h 后換為含血清完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，適時(shí)鏡檢觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)及熒光情況。

2.3.2 電穿孔法轉(zhuǎn)染

1. 細(xì)胞預(yù)處理：胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷電穿孔緩沖液洗滌 2 次，重懸調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10?個(gè) /mL，冰上孵育 10 min 使細(xì)胞適應(yīng)低溫低滲環(huán)境，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性利于穿孔。

2. 電穿孔參數(shù)設(shè)定：針對(duì)不同細(xì)胞系預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，HEK293 細(xì)胞設(shè)電壓 250 V、電容 950 μF、脈沖時(shí)長(zhǎng) 5 ms；HeLa 細(xì)胞 220 V、1000 μF、5 ms；CHO 細(xì)胞 300 V、800 μF、4 ms。將 200 μL 含 1 μg 質(zhì)粒的細(xì)胞懸液加入電擊杯，冰浴放置，避免溫度波動(dòng)影響穿孔效果。

3. 電穿孔操作：將電擊杯置于電穿孔儀電極間，觸發(fā)電脈沖，瞬間電擊后立即取出，室溫靜置 10 min，使細(xì)胞膜修復(fù)穿孔，后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至含 800 μL 預(yù)熱完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，輕柔混勻，37°C、5% CO?孵育，后續(xù)同樣鏡檢及檢測(cè)。

2.3.3 轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性檢測(cè)

1. 轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染 48 h 后，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取 5 個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù) GFP 陽(yáng)性細(xì)胞（發(fā)綠色熒光）與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染效率 = GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù) ×100%）；同時(shí)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)，收集細(xì)胞經(jīng) PBS 洗滌、固定后上機(jī)，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)門(mén)排除自發(fā)熒光干擾，精確統(tǒng)計(jì) GFP 陽(yáng)性率，二者結(jié)合確保數(shù)據(jù)可靠。

2. 細(xì)胞毒性：采用 MTT 法，轉(zhuǎn)染 24 h、48 h 分別向孔內(nèi)加 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37°C 孵育 4 h，棄上清加 DMSO 溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè) 570 nm 吸光度，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞吸光度為對(duì)照（細(xì)胞存活率 = 實(shí)驗(yàn)組吸光度 / 對(duì)照組吸光度 ×100%），直觀(guān)反映細(xì)胞活性變化，評(píng)估轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生存影響。

三、結(jié)果

3.1 不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率對(duì)比

1. 熒光顯微鏡觀(guān)察：在 HEK293 細(xì)胞中，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 48 h 后視野內(nèi)可見(jiàn)較多明亮綠色熒光細(xì)胞，分布相對(duì)均勻，轉(zhuǎn)染效率初步估計(jì)約 60%；電穿孔法下熒光細(xì)胞亮度更高，轉(zhuǎn)染效率超 70%。HeLa 細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率約 50%，電穿孔法達(dá) 65% 左右，部分細(xì)胞呈團(tuán)塊狀高表達(dá) GFP。CHO 細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率偏低，約 40%，電穿孔法則超 55%，但細(xì)胞膜完整性受影響跡象略明顯，少數(shù)細(xì)胞有破裂、皺縮表現(xiàn)。

2. 流式細(xì)胞術(shù)定量：經(jīng)流式精確分析，HEK293 細(xì)胞脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率均值 63.5%，電穿孔法 72.8%；HeLa 細(xì)胞對(duì)應(yīng)為 52.2%、66.7%；CHO 細(xì)胞 41.3%、57.5%，與顯微鏡觀(guān)察趨勢(shì)高度契合，凸顯電穿孔法整體轉(zhuǎn)染效率優(yōu)勢(shì)，尤其在 HEK293 細(xì)胞表現(xiàn)突出，脂質(zhì)體法在 HeLa 及 CHO 細(xì)胞尚有提升空間。

3.2 細(xì)胞毒性評(píng)估

1. MTT 檢測(cè)結(jié)果：轉(zhuǎn)染 24 h，HEK293 細(xì)胞脂質(zhì)體法存活率 85%，電穿孔法 80%；HeLa 細(xì)胞對(duì)應(yīng)為 82%、75%；CHO 細(xì)胞 78%、70%。48 h 時(shí)，HEK293 脂質(zhì)體法存活率降至 78%，電穿孔法 70%；HeLa 細(xì)胞 72%、65%；CHO 細(xì)胞 68%、58%。數(shù)據(jù)表明兩種方法隨時(shí)間延長(zhǎng)均致細(xì)胞活力下降，電穿孔法細(xì)胞毒性上升稍快，CHO 細(xì)胞對(duì)電穿孔耐受性相對(duì)較弱，脂質(zhì)體法在各細(xì)胞系前期細(xì)胞毒性稍低，但后期降幅不可忽視。

四、討論

1. 轉(zhuǎn)染效率差異根源：電穿孔法高效源于強(qiáng)電場(chǎng)瞬間破膜，形成可逆微孔利于核酸快速擴(kuò)散入胞質(zhì)，對(duì)大質(zhì)?；螂y轉(zhuǎn)染基因優(yōu)勢(shì)顯著；脂質(zhì)體法依賴(lài)脂質(zhì)與細(xì)胞膜融合及內(nèi)吞，過(guò)程復(fù)雜易受限，如細(xì)胞膜脂筏分布、內(nèi)吞體逃逸效率影響核酸入核整合，致部分細(xì)胞系轉(zhuǎn)染不佳，尤其膜結(jié)構(gòu)特殊或內(nèi)吞機(jī)制不活躍的 CHO 細(xì)胞。

2. 細(xì)胞毒性機(jī)制：電穿孔直接破壞細(xì)胞膜完整性，雖有修復(fù)但引發(fā)離子失衡、膜蛋白損傷，激活凋亡通路；脂質(zhì)體因脂質(zhì)成分、復(fù)合物大小及細(xì)胞內(nèi)代謝干擾線(xiàn)粒體功能、誘導(dǎo)活性氧生成，長(zhǎng)期孵育積累毒性，在代謝旺盛的 HeLa 細(xì)胞更明顯，故需權(quán)衡轉(zhuǎn)染時(shí)長(zhǎng)與效率，依實(shí)驗(yàn)需求選適宜方法。

五、結(jié)論