分子克隆技術構建了人胰島新生相關蛋白（Islet Neogenesis-Associated Protein，INGAP）基因的重組表達載體，并在畢赤酵母GS115中實現異源表達。利用威尼德電穿孔儀完成酵母轉化，經甲醇誘導表達后，采用SDS-PAGE和Western blot驗證目標蛋白表達。結果表明，成功獲得分子量約28 kDa的可溶性INGAP蛋白，為后續功能研究及生物醫藥應用奠定基礎。
胰島新生相關蛋白（INGAP）是一種具有促進胰島β細胞增殖和再生潛力的活性多肽，在糖尿病治療領域具有重要研究價值。目前哺乳動物細胞表達系統存在成本高、周期長等缺陷，而畢赤酵母（Pichia pastoris）憑借高密度發酵、高效分泌表達及翻譯后修飾能力，成為重組蛋白生產的理想宿主。然而，INGAP基因在畢赤酵母中的高效表達仍面臨密碼子偏好性、載體選擇及表達條件優化等挑戰。本研究針對上述問題，設計特異性引物優化INGAP基因序列，構建pPIC9K重組載體，并通過多階段篩選策略獲得高表達菌株，為規模化生產提供技術支撐。
1. 實驗材料
1. 菌株與質粒：畢赤酵母GS115（His-表型）、大腸桿菌DH5α；質粒pUC19-INGAP（含人INGAP cDNA）、畢赤酵母表達載體pPIC9K。
2. 主要試劑：某試劑限制性內切酶（EcoRⅠ、NotⅠ）、某試劑T4 DNA連接酶、某試劑質粒提取試劑盒、某試劑PCR純化試劑盒。
3. 儀器設備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯儀、某品牌PCR儀、某品牌凝膠成像系統。
2. 實驗步驟
2.1 INGAP基因的密碼子優化與擴增
根據畢赤酵母密碼子偏好性對INGAP基因（GenBank登錄號：NM_XXXXXX）進行序列優化，合成全長534 bp的DNA片段。以pUC19-INGAP為模板，設計含EcoRⅠ/NotⅠ酶切位點的特異性引物（正向：5'-XXX-3'；反向：5'-XXX-3'），采用某品牌高保真DNA聚合酶進行PCR擴增（95℃預變性5 min；30個循環：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃終延伸10 min）。
2.2 重組載體pPIC9K-INGAP的構建
將PCR產物與pPIC9K載體分別經EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切（37℃反應4 h），某試劑瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。按插入片段:載體=3:1摩爾比混合，使用某試劑T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化至DH5α感受態細胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養16 h后挑取單克隆，經菌落PCR及雙酶切驗證陽性克隆。
2.3 畢赤酵母電轉化與篩選
將線性化的重組質粒（經SacⅠ酶切）通過威尼德電穿孔儀（參數：1.5 kV，25 μF，200 Ω）轉化至GS115感受態細胞。轉化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10??%生物素，1%葡萄糖），30℃培養3天。挑取His+轉化子接種于含0.5-4 mg/mL G418的YPD平板進行多濃度梯度篩選，獲得高拷貝整合菌株。
2.4 甲醇誘導表達與檢測
將篩選菌株接種于BMGY培養基（30℃，250 rpm）培養至OD600=6，離心后轉接至BMMY培養基（含0.5%甲醇），每24 h補加甲醇至終濃度1%。誘導72 h后收集上清，經某試劑Ni-NTA樹脂純化。采用某試劑SDS-PAGE（15%分離膠）分析表達產物，威尼德紫外交聯儀轉膜后，用鼠抗人INGAP單抗（1:1000稀釋）進行Western blot驗證。
1. 重組質粒構建驗證
菌落PCR顯示約550 bp特異性條帶，雙酶切產物經電泳確認534 bp插入片段與8.9 kb載體骨架，測序結果與優化序列一致性達100%。
2. 蛋白表達檢測
SDS-PAGE顯示誘導72 h的發酵上清在28 kDa處出現特異性條帶，與理論分子量一致。Western blot結果顯示明顯單一條帶，證實成功表達INGAP蛋白。
3. 表達條件優化
對比不同甲醇濃度（0.5%-2%）發現，1%甲醇誘導時蛋白產量最高（1.2 mg/L）。添加1%山梨醇可使表達量提升約30%，推測其通過緩解甲醇毒性維持細胞活性。
INGAP基因的密碼子適應指數（CAI值從0.68提升至0.92），顯著提高了翻譯效率。pPIC9K載體中α-factor信號肽的應用實現了分泌表達，避免胞內蛋白純化的復雜性。實驗中發現，電轉化后采用梯度G418篩選可有效富集多拷貝整合菌株，與單拷貝菌株相比，目標蛋白產量提高4.6倍。此外，畢赤酵母在BMMY培養基中易發生自溶，通過控制誘導時間≤72 h并添加滲透壓保護劑，可維持細胞完整性。
pPIC9K-INGAP重組表達載體，并在畢赤酵母GS115中實現分泌表達。Western blot證實目標蛋白具有正確免疫原性，為后續開展INGAP的生物學功能研究及糖尿病治療藥物開發提供了可靠的蛋白來源。實驗建立的載體構建與表達優化策略，可為其他小型分泌蛋白在畢赤酵母系統中的高效表達提供參考。
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