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細胞培養基本條件
閱讀：1300 發布時間：2023-3-16
1、細胞培養液
(1)細胞培養水
水的純度通過離子濃度、pH、有機物、膠體、顆粒物及細菌的含量等參數來評定。根據ISO 3696-1987標準將實驗室用水分3級。體外培養的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。配制培養用液應使用三蒸水或超純水(UPW)(1級水)，存放時間一般不應超過2周。
沖洗玻璃器皿，灌注水浴槽、溫箱中的加濕盤、高壓滅菌鍋用水：滿足2級水及以上，多次蒸餾或離子交換制得。
(2)平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS)
用于維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單營養的溶液。主要是由無機鹽、葡萄糖組成，一般用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、分離或配制其他試劑等。如常用的緩沖液：生理鹽水、PBS、Hanks液(常用來配制胰酶溶液)。
(3)培養基
用于維持細胞生長的營養基質，即指所有用于各種目的的體外培養、保存細胞用的物質，就其本意上講為人工模擬體內生長的營養環境，使細胞在此環境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。
天然培養基：指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。因制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基還有血清。合成培養基：根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養基。包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
目前常用培養基：MEM、DMEM、RPM1640、M199、F-10、F-12細胞培養基系列(作為基礎培養基，仍需添加血清)(存在營養成分濃度和多樣性差異，可根據需要進行選擇)。
另有無血清培養基(SFM)通過用適當的營養和激素成分代替血清，避免使用動物血清帶來的問題。無血清培養基可用于多種原代培養和特殊細胞系。優勢：通過適當的生長因子組合使培養基對特定細胞種類具有選擇性。
(4)血清
基礎培養基中最重要的細胞生長和粘附因子,激素、脂質、礦物質的來源。能促進細胞的生長和細胞的貼壁，同時也具有抗胰酶活性。主要成分：各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。優質血清的標準為透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌，支原體，病毒污染。血清的滅活條件56℃，30 min，消除補體活性(根據血清質量決定是否需要滅活)。使用濃度一般為5-20%，最常用是10%。自從有了合成培養基，血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用，過多血清容易使培養中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發生惡性轉化。
常用血清：胎牛血清(FBS)、新生牛血清、小牛血清(CS)、馬血清(HoS)、人血清等
(5)消化液：
蛋白酶溶液：使細胞間的蛋白質水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落，并使細胞游離分散開來，常用濃度：0.1%-0.25%胰蛋白酶。EDTA(乙二氨四乙酸)溶液：作用機制作為螯合劑與鈣黏著蛋白進行結合達到破壞細胞間的連接。EDTA使用濃度為0.02%，配置時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌；對一些貼壁特別牢的細胞，可用EDTA和胰酶的混合液, 如0.25% Trypsin-EDTA。膠原酶：作用于膠原組織，對細胞損傷小。一般多用于組織類及上皮類細胞原代培養時使用。
(6)抗生素溶液
霉素和鏈霉素聯合使用，常稱為“雙抗溶液”。青霉素主要對革蘭氏陽性菌有效，鏈霉素對革蘭氏陰性菌有效；這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常青霉素使用終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。
2、無菌無毒細胞培養環境
細胞培養的成功很大程度上取決于保護細胞免受細菌、真菌、病毒等微生物的污染。細菌、支原體、酵母菌、真菌孢子可能通過操作者、空氣、工作臺面、溶液及其他途徑被引入。無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的首要條件。在體外培養的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質污染，或者自身代謝物質 積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養細胞時，必須保持細胞生存環境無菌無毒，及時清除細胞代謝產物。
3、恒定的細胞生長溫度
動物細胞體外培養的適宜溫度是 37~38℃。溫度過高或過低都會影響到細胞的生長。細胞 耐受低溫的能力比抗熱的能力強，在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂降低。若溫度過低，在 降到冰點以下時，細胞因胞外水和胞質結冰而受損死亡。但若向培養液中加入甘油或二甲亞砜 等保護劑，置于液氮中，可起保護作用，此時細胞可耐受-70℃以下溫度，能長期儲存，解凍 后細胞復蘇，仍能繼續生長增殖，細胞生物性狀不受任何影響。高溫對細胞培養不利。高溫主要引起酶的滅活、類脂質破壞，核分裂的破壞，產生凝固酶使細胞發生凝固，另外使蛋白質變性。
4、滲透壓
細胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外培 養細胞的重要條件之一。哺乳動物和其他動物組織細胞體外培養的滲透壓的維持主要與 NaCl 有關，但不能忽視其他電介質滲透壓的關系。滲透壓與單位體積溶媒內溶質的分子數和離子數 成正比。為此，按一定比例控制培養液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的。這不僅是為 了維持細胞張力，而且是為了調節細胞的代謝。因為細胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養物質的輸送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影響細胞基本合成系統。
理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為 290mmol/L，被視為是體外培 養人類細胞的理想滲透壓。哺乳類動物細胞的滲透壓一般為 290～300mmol/L。人胚肺成纖維 細胞為 250～325mmol/L，鼠則為 310mmol/L 左右。在實際應用中，260～320mmol/L 的滲透壓可適于大多數細胞。
5、氣體環境和 pH
體外培養細胞需要理想的氣體環境，氧和二氧化碳是細胞生存必須的條件之一。氧參加細 胞的三羧酸循環，產生能量以供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。有些細胞在低氧條件 下，可借糖酵解取得能量，但多數細胞低氧時不能生存。氧張力通常維持在略低于大氣狀態， 若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。采用開放式培養時(碟皿或培養瓶松蓋培養或培養板培養)，一般要把細胞置于 95%空氣加 5%二氧化碳的混合氣體環境中。磷酸緩沖劑中的 NaHCO3可供給 CO2，但 CO2易于逸出，故只適用于封閉式培養。若開放式培養還是 置于含有 5% CO2的氣體環境中為宜。為克服 NaHCO3調整的麻煩，也可用羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)，它對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止 pH 迅速變動，在開瓶通培養或活細胞觀察時能維持較恒定的 pH。