Anti-GFP 親和凝膠
MCE 國際站：Anti-GFP Affinity Gel
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件：4℃，2 年禁止凍結
簡介：MCE Anti-GFP 親和凝膠由高品質的 GFP 抗體與瓊脂糖共價偶聯制成，可用于檢測和純化 GFP、EGFP 及其融合表達蛋白，不結合 BFP 標簽蛋白,，也可用于免疫沉淀 (IP) 實驗。
概述：綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein, GFP) 來源于維多利亞多管發光水母 (Aequorea Victoria)，由 238 個氨基酸組成，分子量為 26.9 kDa，其內源熒光基團在收到紫外光或藍光激發時可發射出清晰可見的綠色熒光，且熒光性質穩定。GFP 能在不同的細胞內穩定表達，無種屬、組織和未知特異性，對細胞無毒且檢測方法簡單，將其作為報告基因已廣泛應用于細胞生物學和分子生物學領域。MCE Anti-GFP 親和凝膠由高品質的 GFP 抗體與瓊脂糖共價偶聯制成，具有高載量、高特異性和性質穩定等特點，可用于檢測和純化 GFP、EGFP 及其融合表達蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實驗，不結合 BFP 標簽蛋白。本產品每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取。
描述：
綠色熒光蛋白（GFP）來源于維多利亞水母，由238個氨基酸組成，分子量為26.9kDa。其天然熒光基團在紫外或藍光激發下發出特殊的綠色熒光，具有穩定的熒光特性。GFP可以在各種細胞環境中穩定表達，不受物種、組織或未知特異性的限制。由于對細胞無毒且易于檢測，GFP已被廣泛用作細胞生物學和分子生物學領域的報告基因。
MCE抗GFP親和凝膠是由高品質的GFP抗體與瓊脂糖共價偶聯而成。它具有高負載能力、高效的特異性和穩定性。該凝膠可用于GFP、EGFP及其融合表達蛋白的檢測和純化。此外，它還可用于免疫沉淀 (IP) 測定，而無需與 BFP 標記蛋白結合。
該產品每 1 mL 總體積含有 0.5 mL 凝膠。使用前，請確保凝膠在抽吸前懸浮并混合。
操作說明：蛋白純化樣品在上樣前建議離心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過濾，減少雜質，提高蛋白純化效率。中壓層析柱法1.裝柱：將 Anti-GFP 親和凝膠裝入合適的層析柱中，連接層析柱與色譜系統2.柱平衡：用 5 倍柱體積的結合緩沖液清洗進行柱平衡。重復 2-3 次3.上樣：利用泵或樣品環上樣，收集流出液，可以反復上樣提高結合效率。 注：a. 請根據蛋白量選擇合適凝膠量，上樣量避免超過柱子的結合能力； b. 樣品粘度或體積增加可能會造成層析柱反壓。4) 洗雜：使用 10-20 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液，直至紫外吸收基線趨于平衡。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：繼續使用 5-10 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。注：酸性洗脫后填料要立即用洗滌緩沖液平衡，Anti-GFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min。7) 保存：使用 5-10 倍柱體積凝膠儲存緩沖液平衡層析柱，卸下層析柱，置于 2-8℃保存。2. 重力柱法1) 裝柱：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-GFP 親和凝膠混懸液加入重力層析柱中，去除保護液。2) 柱平衡：使用 5 倍柱體積的結合緩沖液對已裝填好的重力層析柱進行柱平衡。重復 2-3 次。3) 上樣：樣品加入后至少保留 2 min，以保證樣品與介質充分接觸，收集流出液。注：反復上樣可提高結合效率。4) 洗雜：使用 10-15 倍柱體積的洗滌緩沖液進行洗雜，以去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5-10 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。注：酸性洗脫后填料要立即用洗滌緩沖液平衡，Anti-GFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min。7) 保存：使用 5 倍柱體積凝膠儲存緩沖液平衡層析柱，置于 2-8℃保存。3. 離心法1) 凝膠預處理：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-GFP 親和凝膠混懸液加入離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。加入 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，5000 g 離心 1 min，棄上清，重復 2-3 次。2) 結合：加入樣品，封閉離心管，4°C 孵育 2-4 h (或 37°C 孵育 0.5-2 h)。3) 洗滌：孵育完成后，5,000 g 離心 1 min，棄上清 (上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)。使用 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，5,000 g 離心 1 min，棄上清，重復 3-5 次。4) 洗脫：使用 3-5 倍凝膠體積的洗脫緩沖液進行洗脫，室溫孵育 5 min，5,000 g 離心 1 min，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。可重復 2-3 次并分別收集上清液。注：酸性洗脫后填料要立即用結合緩沖液平衡，Anti-GFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min；洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。5) 再生及保存：使用 5-10 倍凝膠體積的洗滌緩沖液沖洗介質，再用 5-10 倍凝膠體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍凝膠體積的凝膠儲存緩沖液沖洗，置于 2-8°C 保存。免疫沉淀1. 凝膠預處理1) 將 Anti-GFP 親和凝膠重懸混勻，吸取 40 μL 凝膠懸液（約 20 μL 凝膠）至干凈的 1.5 mL 離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。2) 加入 500 μL 洗滌緩沖液，混合均勻，5000 g 離心 1 min，棄上清。重復 3-4 次。2. 樣品結合1) 在上述清洗干凈的凝膠中加入 200-1,000 μL 樣品。充分混勻后，置于翻轉混合儀上孵育，4℃ 孵育 2 h。如需提高結合效率，可過夜孵育。注：對于易降解的蛋白，建議添加蛋白酶抑制劑。2) 5,000 g離心 1 min，將上清轉移至新離心管 (上清液可用于檢測 GFP 標簽蛋白是否有殘留)。3. 洗滌在上述分離得到的凝膠中加入 500 μL 洗滌緩沖液，充分混懸凝膠，5,000 g 離心 1 min，棄去上清。重復以上洗滌步驟 3 次以上，直到洗滌后的上清液中 OD280 小于 0.05 為止。注：多次洗滌的目的是確保去除非特異性吸附，如上清液的 OD280 大于 0.05，可增加洗滌次數。4. 洗脫提供兩種洗脫方案，可根據需要選擇不同的洗脫方案。1) 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50-100 μL 洗脫緩沖液，充分混勻后室溫孵育 5 min，5,000 g離心 1 min，收集上清并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。2) 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 20-50 μL 2× SDS-PAGE Loading Buffer，充分混勻后 95℃ 加熱 5 min。5000 g離心 1 min，取上清進行 SDS-PAGE 電泳檢測。注：由于常規 SDS-PAGE Loading Buffer 中含有 β-疏基乙醇和 DTT會使填料中抗體輕重鏈斷開，同時含有 SDS 的 Loading Buffer 可以使介質配體變性，因此變性洗脫后的 Anti-GFP 親和凝膠不能重復使用。
注意事項：1. 本產品使用前務必充分重懸凝膠。2. 使用本產品進行 IP 實驗前，需先確認樣品中 GFP 標簽蛋白的表達情況。3. 為最大限度的降低蛋白質降解，請配合使用 MCE 蛋白酶抑制劑 cocktails (MCE 貨號 HY-K0010，HY-K0011)。4. 不要使用含有 DTT 的細胞裂解液樣品，DTT 可能會引起凝膠上的 GFP 抗體脫落5. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
銷售產品：CPTH2 | Pirinixic acid | Deoxycholic acid | Deferasirox | Methyl cellulose | Fibronectin, Human | Coenzyme Q10 | 5-Aminosalicylic Acid | GIP, human (TFA) | Campesterol
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