無縫克隆試劑盒
MCE 國際站：Seamless DNA Assembly Plus Kit
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20℃ 2 年避免反復凍融
簡介：MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit 無縫克隆試劑盒為新一代重組克隆試劑盒，一次反應可完成單個至多個 DNA 片段的重組。其中經優化的 Mix 預混了重組酶和反應緩沖液，并添加了輔助因子，可顯著提高克隆的重組效率和對雜質的耐受度，最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高達 95% 以上。
概述：與傳統的克隆方法不同，無縫克隆技術基于基因重組原理，在目的基因引物 5′ 端引入了一段與線性化載體末端同源的堿基序列（一般為 15-20 bp），在重組酶的作用下即可將目的基因插入線性化載體中，是一種操作簡單、高效且快速的 DNA 定向克隆技術。MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit 無縫克隆試劑盒為新一代重組克隆試劑盒，一次反應可完成單個至多個 DNA 片段的重組。其中經優化的 Mix 預混了重組酶和反應緩沖液，并添加了輔助因子，可顯著提高克隆的重組效率和對雜質的耐受度，最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高達 95% 以上。
描述：
無縫克隆是基于基因重組的一種簡便、高效、快速的DNA克隆技術，在插入片段引物的5’端添加與線性化載體末端同源的15-20bp序列，在酶的作用下，可輕松實現重組。
MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit含有優化的重組酶、反應緩沖液和附加輔因子混合物，可顯著提高克隆效率和對雜質的耐受性。該產品可完成多個DNA片段重組，單個片段重組僅需5分鐘，陽性率達95%以上。
操作說明：1. 載體線性化處理選擇合適的克隆位點，對環形載體進行線性化處理。以下兩種方法任選其一即可。a. 酶切處理建議使用雙酶切，可減少載體自連，降低假陽性克隆概率。若使用單酶切，建議適當延長酶切反應時間。酶切處理后，建議進行電泳驗證，并對線性化載體切膠純化。b. 反向 PCR 擴增以預線性化質粒為模板，推薦選擇 MCE 高保真聚合酶（2× High-Fidelity PCR Master Mix, Cat. No.: HY-K0533）進行擴增。2. 目的基因擴增a. 目的基因引物設計原則無縫克隆反應要求目的基因與相鄰片段具有 15-20 bp 的末端同源性，所以目的基因上下游引物的 5′ 端均需包含一段與已知線性化載體末端同源的堿基序列，引物總長度最好不要超過 40 bp，Tm 值一般在 55-65°C，GC 含量一般在 40-60%。上游引物（Primer F）：5′—上游載體末端同源序列 + 酶切位點（可選擇）+ 目的基因特異性正向序列—3′下游引物（Primer R）：3′—目的基因特異性反向序列 + 酶切位點（可選擇）+ 下游載體末端同源序列—5′注：1) 目的基因特異性正\反向序列即常規插入片段正\反向擴增引物序列。2) 上游\下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組）b. 目的基因 PCR 擴增推薦選擇 MCE 高保真聚合酶（2× High-Fidelity PCR Master Mix, Cat. No.: HY-K0533）進行擴增。擴增結束后，建議對 PCR 產物進行純化后再用于后續無縫克隆反應。3. 無縫克隆a. 在冰上配制反應體系本反應體系最適載體用量為 0.03 pmol。當插入單個目的基因時，目的基因與載體的最適摩爾比為 2:1。當插入多個目的基因時，每個目的基因與載體的最適摩爾比為 1:1。注：1) 若目的基因長度大于載體長度時，應互換載體與目的基因的用量，即將目的基因當做載體，將載體當做目的基因再進行計算。2) 線性化載體的使用量在 50-200 ng 之間，目的基因的使用量在 10-200 ng 之間。若按照上述公式計算得到的使用量超出這個范圍，建議直接選用/最高使用量。3) 若目的基因小于 200 bp 時，建議目的基因與載體的摩爾比為 5:1.4) 若使用未經純化的線性化載體或目的基因時，加樣體積不應超過總反應體積的 20%。5) 載體或目的基因片段過長均會導致重組效率降低。b. 用移液槍輕輕吹打混勻（切勿振蕩），短暫離心后置于 50°C 反應 5-60 min。注：1) 推薦使用 PCR 儀等溫控較精準的儀器，反應時間過長或過短均會降低克隆效率。2) 當插入 1-2 個片段時，推薦反應 5-15 min；當插入 3-5 個片段時，推薦反應 15-30 min。3) 若載體大于 10 kb 或目的基因大于 4 kb 時，建議延長反應至 30-60 min。c. 將反應液短暫離心后置于冰上冷卻，用于后續轉化。注：重組產物可于 -20°C 暫存一周，待需要時解凍轉化即可。4. 轉化a. 在冰上解凍 100 μL 感受態細胞。禁止直接用手化凍，會影響感受態細胞的活性。b. 在解凍后的感受態細胞中，加入 10 μL 重組產物，輕輕混勻，在冰上放置 30 min。c. 將上述反應液于 42°C 水浴熱激 45-60 s，迅速放到冰上冷卻 5 min。d. 加入 500 μL LB 或者 SOC 液體培養基（不含抗生素），37°C，180 rpm 培養 1 h。e. 將菌液離心濃縮后涂布在含相應抗生素的固體平板上，37°C 倒置培養過夜。注：1) 不同感受態細胞的陽性克隆率有所區別，推薦使用轉化效率較高的感受態細胞。2) 陽性對照平板通常出現大量菌落，而陰性對照幾乎沒有菌落。5. 陽性克隆子的篩選與鑒定過夜培養后，理論上重組平板會出現數百個單菌落，挑取單菌落進行驗證。以下兩種方法任選其一即可。注：為確保實驗準確性，建議將以下兩種方法篩選出的陽性克隆子測序。a. 酶切驗證挑取單菌落接種至含抗生素的液體培養基中培養，提取質粒后進行酶切驗證。b. 菌落 PCR挑取單菌落至 10 μL ddH2O，95°C 裂解 10 min。取 1 μL 裂解液作為模板，直接進行菌落 PCR。菌落 PCR 擴增時至少使用一條通用引物，以免造成假陽性。
注意事項：1. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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