運用Pure系統(tǒng)
快速純化各種范圍的多肽
Pure應(yīng)用
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簡介
肽序列的新發(fā)現(xiàn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提供了新的藥物開發(fā)候選。天然產(chǎn)物和合成肽的純化過程是藥物開發(fā)過程中的重要步驟，通常使用制備型 HPLC 來完成，這可能既昂貴又耗時。Flash 快速制備色譜是純化合成肽和其他小分子藥物的快速且經(jīng)濟高效的方法。使用 Flash 快速制備色譜可以快速增加肽的總體純度，然后再添加下一個氨基酸或在制備型 HPLC 上進行最終精制。
這項工作證明了使用具有 ELSD 和 UV 檢測功能的 Pure 色譜系統(tǒng)可以純化和回收多種肽。與制備型 HPLC 色譜柱相比，F(xiàn)lashPure C18 柱顯示出高負載能力和高分離度的肽純化能力，單次進樣可處理更多量的肽。并且與制備型 HPLC 相比，F(xiàn)lash 快速制備色譜減少了純化時間和溶劑使用量。
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實驗
通過這項工作，我們開始測試Flash快速制備色譜是否對純化多種肽有任何優(yōu)勢。所以，我們選擇肽樣品的大小范圍從幾個氨基酸到長度為32個氨基酸。為了測試裝載能力的優(yōu)勢，我們在 12g FlashPure C18、60?， 40μm 柱子中裝載了 30mg–1g 多肽抗生素（多粘菌素B硫酸鹽）。
接下來，我們測試了 Pure 快速純化的能力，以充分混合在分離肽和小氨基酸（牛磺酸（35mg）+萬古霉素（45mg）+多粘菌素（56mg）。
樣品：
多肽，氨基酸和多肽抗生素（Sigma Aldrich）
合成肽混合物（California Peptide Research, Inc）
設(shè)備：
Pure 分離純化系統(tǒng)（BUCHI）
耗材：
Flash Pure C18（BUCHI）
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結(jié)果與討論
評估60?，40μm C18色譜柱的載樣能力
為了測試載樣能力，將 30mg–1g 的多粘菌素B硫酸鹽裝入12g FlashPure C18 中，通常來講 HPLC 的典型制備上樣量為柱子填料量的 0.1- 1.0％。而快速純化載樣數(shù)據(jù)表明，可加載 0.1–10％ 的樣品而不會對色譜柱產(chǎn)生不利影響。這意味著與通常需要多次進樣的單獨制備型HPLC相比，使用快速純化可以在一次進樣中處理更大量的粗肽。與此同時，可以使用更少的溶劑和更少的時間來純化大量的樣品。Pure 純化系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是能夠使用干法上樣方式為低溶解度樣品提供更高的負載量。
▲ Polymyxin B 的快速純化載樣數(shù)據(jù)表明，上樣量可達分離柱質(zhì)量的 0.1–10％，而對回收率沒有不利影響。
評估多肽混合物的分離
包含兩個多肽（萬古霉素和硫酸多粘菌素B）和一個小氨基酸（?；撬幔┑臏y試混合物證明了 Pure 快速純化系統(tǒng)能夠充分分離肽混合物的能力。結(jié)果表明，使用 60?，40μm C18 介質(zhì)進行快速純化可充分分離出三種具有對稱峰形的化合物。UHPLC證實了萬古霉素和硫酸多粘菌素B的純度均高于 98％?；旌衔镌?0分鐘內(nèi)純化，這比使用制備型 HPLC 純化相同混合物快約4倍。除此之外，結(jié)合了 UV 和 ELSD 雙檢測器系統(tǒng)的另一個好處是，可以檢測和收集未反應(yīng)的氨基酸片段和無紫外吸收產(chǎn)物。以此為例，?；撬醿H被 ELSD 檢測到。
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結(jié)論
結(jié)果表明，Pure 系統(tǒng)與反相 C18 色譜柱的結(jié)合使用可成功用于純化多種從單個氨基酸到大肽的肽段（接近5000 MW）。根據(jù)圖譜顯示，Pure 分離純化系統(tǒng)可以單獨使用，也可以在制備型 HPLC 之前用作預(yù)純化步驟，這可以提高肽段純化過程的效率。數(shù)據(jù)表明，樣品的上樣量可達到快速色譜柱填料量的 10％，并使用快速色譜法成功純化。這意味著，與通常需要多次進樣的單獨制備型 HPLC 相比，使用快速純化在一次進樣中可以在更短的時間內(nèi)處理大量的粗肽。自動快速色譜的另一個好處是能夠使用干法上樣的進樣技術(shù)為低溶解度的樣品提供更高的負載量。將 UV 和蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）結(jié)合使用的另一個優(yōu)點是，可以檢測和收集未反應(yīng)的氨基酸片段和無紫外吸收的產(chǎn)物。
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