八聚體錐形孔跨膜蛋白——MspA蛋白
恥垢分枝桿菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一種通道形成蛋白，用于小分子和水的通道。MspA是分子量 20 kDa 的單體蛋白構建的同源性八聚體，其形狀為“八"字形杯狀結構。MspA長度大約 1 nm，具有大約1 nm的寬度收縮區(qū)，兩側有明顯較大的直徑區(qū)域。
MspA 擁有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在 100℃的溫度下活性能耐受 30 min，在80℃的2% SDS條件中培養(yǎng)15分鐘依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范圍內保持穩(wěn)定，同時MspA具有易于進行多位點突變修飾。
圖1 MspA突變體的結構與表達
MspA是一種納米孔分析的理想材料
MspA 的幾何形狀可以提供很好的空間分辨率，因為離子電流阻塞的特征主要是由穿過孔隙狹窄區(qū)域的多核苷酸片段決定的。另外，MspA 擁有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，最后，MspA可以為多種氨基酸替代保留高水平表達和通道活性，是一種通過定點誘變進行工程設計的理想選擇。近年來，MspA蛋白在單分子檢測領域的研究和應用得到越來越多關注，MspA蛋白納米孔最重要的應用集中在DNA測序方面，主要用于檢測表征ssDNA。
圖2 納米孔測序原理
MspA在生物和醫(yī)學展現應用潛力
MspA作為一種具有錐形結構的八聚體孔道蛋白，通過引入突變開發(fā)工程化MspA孔道，可以實現多種單糖直接區(qū)分，說明MspA是核酸與多種生物大分子檢測的有力品。
MspA是細菌細胞外膜上親水性營養(yǎng)溶質的主要通道，負電性密集的收縮區(qū)具有天冬氨酸的雙圈結構，能夠與陽離子結合。使用合適的通道阻斷劑可以堵塞MspA蛋白孔，則親水性營養(yǎng)溶質不能輸送進細菌體內，造成細菌休眠，同時可以破壞細胞外壁的穩(wěn)定性，增強細菌的抗生素易感性，對于疾病治療具有重要作用。
圖3 MspA實現單糖區(qū)分
珀羅汀基于無細胞體系成功表達MspA八聚體跨膜蛋白
客戶案例
收到MspA序列后，珀羅汀構建融合了GFP的線性化表達模版，隨后，采用自主研發(fā)的PLD無細胞蛋白表達試劑盒（膜蛋白（或困難蛋白）表達增強版，#PLDK002）進行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進行合適的表面活性劑篩選，對于目的蛋白的表達結果采用SDS-PAGE進行鑒定。
圖4 目的蛋白表達鑒定
（channel 1：空白對照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達情況；channel 11：marker）
之后，選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無細胞蛋白表達體系進行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結果顯示，channel 5的無細胞蛋白表達方案可以正確表達該MspA的單體與多聚體。
圖5 MspA目的蛋白表達鑒定
客戶評價
這次選擇比較新穎的無細胞蛋白表達體系進行MspA表達，珀羅汀僅用4天完成小試，相當快速，膠圖結果中單體和多聚體的亞基都是對的。相比于細胞表達體系，無細胞體系可以輕松實現多亞基膜蛋白表達及正確組裝的難題。對于復雜多亞基超結構膜蛋白的結構研究和物理、化學、生物性質研究而言，這無疑是巨大的福音。
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Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).
SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).
Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).
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