蛋白質(zhì)是生命體的基本組成部分，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)研究對于理解生命本質(zhì)、疾病診斷和治療、新藥開發(fā)等都具有重要意義。而蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)在蛋白質(zhì)研究中扮演著至關(guān)重要的角色，它不僅突破了自然進(jìn)化的限制，允許研究人員創(chuàng)造出具有全新或功能優(yōu)化的蛋白質(zhì)，還加速了新藥研發(fā)進(jìn)程，推動(dòng)工業(yè)酶的優(yōu)化，并為合成生物學(xué)的發(fā)展提供了有力支持。
今天小編和大家分享一項(xiàng)今年9月份發(fā)表在《Protein Science》上的研究，作者介紹了CFPS在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，并探討了其優(yōu)勢、挑戰(zhàn)及未來發(fā)展方向。
一、研究背景
蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是創(chuàng)建具有特定功能的蛋白質(zhì)，目前，基于物理的方法雖然能夠提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，但成功率相對較低。相比之下，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法顯著提高了設(shè)計(jì)的成功率，但設(shè)計(jì)失敗的情況仍然普遍。而且，無論采用哪種方法，最終都需要通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)是否具有預(yù)期的功能。當(dāng)前主要的挑戰(zhàn)是從數(shù)十到數(shù)百個(gè)設(shè)計(jì)中篩選出那些具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì)，并且要明確設(shè)計(jì)失敗的原因，包括表達(dá)和可溶性問題以及未能形成正確的結(jié)構(gòu)和功能的原因。因此，尋找一種高效、便捷的方法來篩選和驗(yàn)證蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)顯得尤為重要。
二、無細(xì)胞蛋白合成在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用
無細(xì)胞蛋白合成（CFPS）提供了一種更為簡單的方法來識別功能性設(shè)計(jì)，并能解釋設(shè)計(jì)為何未能如預(yù)期般表現(xiàn)。CFPS相比在傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的方法具有多個(gè)優(yōu)勢，如不受宿主細(xì)胞存活限制、可生產(chǎn)細(xì)胞毒性蛋白、反應(yīng)僅由目標(biāo)DNA編程、條件易于調(diào)整、適合小體積篩選且成本低。此外，CFPS更便于生產(chǎn)制造和測試設(shè)計(jì)蛋白的功能，并探索設(shè)計(jì)失敗的原因，從而可以提供豐富的數(shù)據(jù)集以優(yōu)化后續(xù)設(shè)計(jì)等。
圖1:表示功能性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的識別的示意圖
三、活性篩選
在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中，篩選活性是關(guān)鍵步驟之一。CFPS作為一種高效且靈活的方法，在這一過程中發(fā)揮了重要作用，它可以快速評估蛋白質(zhì)的活性，同時(shí)還能幫助識別設(shè)計(jì)失敗的原因。此外，CFPS可以在微孔板或微流控設(shè)備中進(jìn)行，反應(yīng)體積小，適合大規(guī)模篩選。例如，通過熒光或比色法可以直接檢測酶活性，而無需復(fù)雜的純化步驟。CFPS還可以用于高通量篩選，例如Rapp等人通過機(jī)器人自動(dòng)化系統(tǒng)結(jié)合CFPS來探索蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和活性。這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠在短時(shí)間內(nèi)排除無效的設(shè)計(jì)。從而快速篩選出功能性蛋白質(zhì)，還能為設(shè)計(jì)失敗提供寶貴的信息，從而指導(dǎo)后續(xù)的設(shè)計(jì)改進(jìn)，例如，de los Santos等人通過CFPS篩選出具有特定DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子突變體，Rolf等人通過優(yōu)化反應(yīng)條件提高酶的可溶性產(chǎn)量?？傊?，CFPS是一種簡單、信息豐富且易于操作的技術(shù)，非常適合用于蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和驗(yàn)證流程。
圖2:使用CFPS評估蛋白質(zhì)功能的案例
四、表面捕獲的CFPS產(chǎn)生的蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)表面捕獲是評估蛋白質(zhì)功能的重要手段。通過將蛋白質(zhì)產(chǎn)品固定到固體表面上，可以將其與CFPS試劑分離，從而通過清洗表面實(shí)現(xiàn)這一目的。這使得可以在不同條件下測試蛋白質(zhì)活性，如pH值、溫度、緩沖液成分以及對不同底物的反應(yīng)性。并且可以測試每個(gè)突變體在多種條件下的表現(xiàn)。如，PISA（Protein In Situ Array）技術(shù)通過鎳涂層表面捕獲帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)高通量功能檢測。最近，Thornton將自組裝蛋白質(zhì)表面用于共價(jià)捕獲無細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)。具體來說，可通過His標(biāo)簽蛋白、生物素化的DNA、BslA-SpyTag 形成自組裝蛋白質(zhì)單層等策略來實(shí)現(xiàn)表面補(bǔ)獲。這些方法不僅能夠高效地捕獲蛋白質(zhì)，還能夠在不同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的測試，從而為蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和功能研究提供了強(qiáng)大的工具。
圖3:CFPS的表面捕獲策略示例
五、CFPS用于識別設(shè)計(jì)失敗的原因
當(dāng)前蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)可能因多種原因而“失敗"，不僅僅是未能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能。而CFPS能夠幫助識別導(dǎo)致設(shè)計(jì)失敗的原因，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、聚集和錯(cuò)誤折疊等問題。例如通過添加染料結(jié)合適配體序列測試轉(zhuǎn)錄，通過融合熒光蛋白或四半胱氨酸迷你螺旋標(biāo)簽測試翻譯，通過熒光賴氨酸殘基或放射性氨基酸測試溶解度，通過高通量蛋白酶切試驗(yàn)評估蛋白質(zhì)折疊。
通過這些方法收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以幫助區(qū)分設(shè)計(jì)失敗的不同原因，從而利用數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的方法識別可能導(dǎo)致失敗的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的特性，并將這些結(jié)果納入未來的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)算法中。這不僅有助于提高設(shè)計(jì)成功率，還能為蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域提供寶貴的反饋信息。
圖4:CFPS來識別蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)可能的失敗點(diǎn)
六、結(jié)論
CFPS作為一種快速、靈活且多功能的技術(shù)，相對于傳統(tǒng)表達(dá)方法的優(yōu)勢顯著，適合用作多種蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)項(xiàng)目的中介篩選工具，無細(xì)胞系統(tǒng)能夠?qū)嵤└鞣N功能檢測，這使得研究人員可以輕松評估不同設(shè)計(jì)的功能（而不僅僅是結(jié)構(gòu)）。通過結(jié)合計(jì)算設(shè)計(jì)（機(jī)器學(xué)習(xí)等）和高通量篩選，CFPS不僅提高了蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的成功率，還加速了新功能蛋白的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。在中等通量水平下，CFPS為研究人員提供了一種可行的技術(shù)，可以并行測試多種蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的功能。因此，可以預(yù)見CFPS將在未來成為促進(jìn)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的更加重要的工具。
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