細胞膜是細胞與外界環(huán)境的分界線，而膜蛋白（MPs）作為細胞的基本組成成分，介導許多關(guān)鍵過程，如信號轉(zhuǎn)導、成分傳輸、酶反應、細胞之間的通信等。在生命科學領(lǐng)域，研究膜蛋白對于理解細胞功能、疾病機制及藥物開發(fā)具有重要意義。膜蛋白的表達與純化一直是研究中的難點，其復雜的結(jié)構(gòu)、疏水性、低表達量、易形成包涵體以及潛在的毒性使得傳統(tǒng)表達方法面臨諸多挑戰(zhàn)。而無細胞蛋白表達技術(shù)（ CFPS）的興起，為膜蛋白研究帶來了革命性的變革。
一、膜蛋白表達的挑戰(zhàn)
膜蛋白作為一類特殊的蛋白質(zhì)，其表達與純化過程尤為復雜。除了常見的問題外（比如：膜蛋白定位、跨膜蛋白疏水性、蛋白毒性、表達水平低等），還有以下一些挑戰(zhàn)：
稀有密碼子：部分膜蛋白基因含有稀有密碼子，這些密碼子不能被宿主細胞識別，導致多肽鏈合成不完-全，從而不能形成功能性膜蛋白。
易形成多聚體：膜蛋白在熱變性過程中容易形成多聚體，導致抗體無法識別或條帶分子量發(fā)生變化或扭曲，從而影響實驗結(jié)果。
提取方法復雜：由于膜蛋白與膜結(jié)合緊密，不易從膜上洗滌下來，特別是跨膜蛋白，具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域，提取分離困難。目前常用的提取方法包括超速離心、密度梯度離心等，但每種方法都有其局限性。
檢測難度大：膜蛋白在樣品中的表達量通常不高，在總蛋白中占比較低，用總蛋白檢測時，目標蛋白含量可能低于檢測下限，無法檢測到。此外，膜蛋白的western Blot實驗也面臨諸多挑戰(zhàn)，如條帶不清晰、分子量不對或條帶扭曲等。
二、CFPS技術(shù)在膜蛋白研究中的優(yōu)勢
對于體外結(jié)構(gòu)研究來說（如X射線衍射、核磁共振光譜或交聯(lián)方法等）CFPS已經(jīng)成為一個日益重要的研究領(lǐng)域，并且它在其他領(lǐng)域也有很高的潛力，包括工業(yè)蛋白質(zhì)生產(chǎn)等。一般來說，CFPS可以在不使用完整活細胞的情況下進行體外蛋白的合成，只需要合成系統(tǒng)中包含核糖體和氨基酰tRNA合成酶等核心蛋白質(zhì)表達機制的細胞提取物，同時提供能量恢復系統(tǒng)、氨基酸、NTP、tRNA和DNA等必需的前體即可。與重組蛋白生產(chǎn)相比，它有以下幾個主要優(yōu)勢：
CFPS可以表達對細胞有損害的蛋白質(zhì)或肽，包括膜整合蛋白、疫苗等；
CFPS系統(tǒng)允許通過不同的策略有效地納入非天然氨基酸（NSAA）；
CFPS的蛋白純化過程可簡化為一兩個親和力純化步驟，表達后的提取物也可以直接應用于下游工作；
CFPS過程中免去了許多耗時和關(guān)鍵的步驟（比如細胞培養(yǎng)）；
CFPS允許在開放系統(tǒng)中直接解決降解、錯誤靶向或不溶性表達等問題，允許獨立于細胞活力或生長的情況下優(yōu)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
總而言之，CFPS系統(tǒng)比重組系統(tǒng)具有優(yōu)勢，因為它的開放性允許精確控制環(huán)境，包括添加劑和氨基酸，并易于獲得表達的蛋白質(zhì)。此外，這些系統(tǒng)促進了適用于高吞吐量需求的簡單優(yōu)化程序，這使得它對自動化流程更具有吸引力，并且允許高效地納入非天然氨基酸。
圖1:無細胞蛋白表達技術(shù)合成膜蛋白的實驗方案
三、CFPS技術(shù)在膜蛋白研究中的具體應用
CFPS系統(tǒng)是膜蛋白合成的一種新的核心平臺。其在人工疏水環(huán)境中的表達允許膜蛋白的共翻譯溶解和折疊，如納米膜或膠束。在沒有疏水化合物的情況下，合成的膜蛋白可定量沉淀，同時仍然可以保留很大一部分折疊的結(jié)構(gòu)元素。即使是復雜的膜蛋白（比如大型轉(zhuǎn)運體），也可以在幾個小時內(nèi)合成大量此類沉淀物。沉淀物可以在洗滌劑中溶解或重組成膜，以進行后續(xù)的結(jié)構(gòu)或功能分析。
我們知道，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在細胞-細胞信號傳導過程中發(fā)揮著核心作用，是人類基因組中最大的膜蛋白群體，大約35%的商業(yè)藥物是針對這些蛋白質(zhì)。對G蛋白偶聯(lián)受體進行結(jié)構(gòu)研究的先決條件是制備以毫克蛋白質(zhì)為單位的高度濃縮、穩(wěn)定且具有生物活性的樣本。傳統(tǒng)的表達方法會存在很多問題，而CFPS可以規(guī)避這些問題。基于其開放性，允許研究人員向系統(tǒng)中添加物質(zhì)。這促進了蛋白表達和溶解，允許快速篩選出最佳表達條件。
圖2：作為藥物靶點的GPCRs系統(tǒng)發(fā)育樹
此外，膜基納米顆粒（如脂質(zhì)體、聚合物和脂質(zhì)納米顆粒）的表面改性，以及靶向分子（如結(jié)合蛋白）的修飾是治療材料設計的重要一步。然而，這種修飾可能既昂貴又耗時，需要細胞宿主進行蛋白質(zhì)表達，將會花費漫長的純化和共軛時間來將蛋白質(zhì)附著在納米載體表面，這最終限制了有效蛋白質(zhì)共軛納米載體的發(fā)展。目前，已有研究使用CFPS系統(tǒng)來快速創(chuàng)建蛋白質(zhì)共軛膜基納米載體。使用這種方法，多種類型的功能結(jié)合蛋白，包括affibodies、scFvs等，都可以通過無細胞表達，并在一個鍋中結(jié)合到脂質(zhì)體上。此外，可以進一步擴展到其他納米顆粒，包括聚合物和脂質(zhì)納米顆粒，適用于多種共軛策略，包括表面附著以及集成到納米顆粒膜中。利用這些方法，證明了雙特異性人工抗原呈遞細胞的快速設計，并增強了脂質(zhì)納米顆粒貨物的體外輸送。預計這種工作流程將能夠快速生成基于膜的輸送系統(tǒng)，并增強我們創(chuàng)建細胞模仿療法的能力。
圖3：膜基納米顆粒的快速合成
四、總結(jié)
CFPS技術(shù)正引膜蛋白研究的革命性突破，它不僅解鎖了膜蛋白研究的新篇章，還預示著在結(jié)構(gòu)生物學、藥物研發(fā)和生物傳感器技術(shù)等前沿領(lǐng)域的無限可能。隨著技術(shù)的日益完善，我們有充分的理由期待，這項技術(shù)將極大促進膜蛋白功能的深刻理解，加速新藥研發(fā)進程，并為生命科學的深入探索提供強有力的技術(shù)支持，為人類的健康福祉和科技進步貢獻力量。
珀羅汀生物依托自主研發(fā)的無細胞蛋白表達平臺，已成功實現(xiàn)對膜蛋白的高效快速合成，成為膜蛋白表達的救星。
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