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一、實驗?zāi)康?/p>
? 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理;
? 掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù);
? 掌握美析V-1500可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。
二、實驗原理
紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。
進(jìn)行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對強(qiáng)度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。
定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。
光度分析時，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強(qiáng)度為I0，通過待測溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對數(shù)值即吸光度。
紫外-可見分光光度計:紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成，即
由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A。可見光區(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。
本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點。
特點：帶光譜
分子光譜
應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長
定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）
根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。
三、儀器與試劑
美析V-1500可見分光光度計，比色管，吸量管
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液
0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液
四、實驗步驟
<一>準(zhǔn)備工作
1. 啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。
2. 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。
3. 將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。
4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。
<二>測量工作
1.吸收曲線的繪制:
用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻 度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測量吸光度。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ：
用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5 mL 5.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。
3. 樣品測定：
取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平 行測定三份。
五、數(shù)據(jù)處理：
1. 以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長。
由吸收曲線可得最大吸收波長λmax=278nm(圖略)
2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL) | 吸光度A |
0.25 | 0.171 |
0.50 | 0.335 |
0.75 | 0.482 |
1.00 | 0.637 |
1.25 | 0.796 |
濃度C-吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186
曲線擬合優(yōu)度: R2=0.9998
3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。
平行測定次數(shù) | 樣品液吸光度A | 樣品溶液濃度C(mg/mL) |
1 | 0.676 | 1.059 |
2 | 0.672 | 1.053 |
3 | 0.674 | 1.056 |
所測溶液平均濃度: C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL
測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差： =0.003
相對標(biāo)準(zhǔn)偏差： =0.284%
待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。
六、思考題:
紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點？受哪些因素的影響和限制？
優(yōu)點：該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點。
缺點：儀器昂貴，而且不同的蛋白質(zhì)的紫外吸收是不相同的，測定結(jié)果存在著一定的誤差。
七、注意事項:
1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，蛋白質(zhì)溶液濃度要準(zhǔn)確配制，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液;
2.測量吸光度時，比色皿要保持潔凈，切勿用手玷污其光面;
3.石英比色皿比較貴重，使用時要小心。
