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杭州實了個驗生物科技有限公司
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瀏覽次數熒光定量PCR儀（Fluorescence Quantitative PCR, 簡稱qPCR）是一種結合了聚合酶鏈式反應（PCR）和熒光信號檢測技術的儀器，用于實時監測和定量分析DNA或RNA的擴增過程。與傳統的PCR不同，qPCR在每個擴增循環中都可以通過熒光信號實時跟蹤擴增產物的數量，從而實現對目標核酸的定量分析。
一、熒光定量PCR儀的工作原理
熒光定量PCR儀基于經典的PCR技術進行DNA或RNA擴增，但其核心創新在于在擴增過程中通過熒光標記實時監測核酸產物的生成。這一過程通常包括以下幾個步驟：
1.1 PCR擴增循環
qPCR遵循標準的PCR擴增步驟，主要包括：
變性：在高溫下（94-98°C），雙鏈DNA分解成單鏈。
退火：在較低的溫度下（50-65°C），特異性引物與目標DNA模板結合。
延伸：在合適溫度下（72°C），DNA聚合酶通過模板合成新的DNA鏈。
每一次循環都導致目標DNA片段的倍增，擴增產物數量呈指數級增加。
1.2 熒光檢測
熒光定量PCR通過熒光染料或特異性熒光探針來標記擴增的DNA。隨著PCR反應的進行，DNA產物的數量增加，熒光信號也隨之增強。熒光定量PCR儀中的光學系統在每個循環的延伸階段檢測熒光強度，并將其與擴增產物數量相關聯。
有兩種常見的熒光標記方法：
SYBR Green染料：這種染料與雙鏈DNA結合后會發出熒光，擴增產物越多，熒光信號越強。SYBR Green染料適用于檢測任何DNA片段，但可能產生非特異性擴增產物的熒光信號。
TaqMan探針：TaqMan探針是一種特異性探針，具有熒光報告基團和猝滅基團，能夠特異性識別目標序列。只有當探針被DNA聚合酶降解時，報告基團才會發出熒光，確保更高的特異性。
1.3 定量分析
qPCR儀器通過記錄每個循環的熒光信號，建立目標核酸擴增產物的標準曲線或使用相對定量方法，推測出起始樣本中目標基因的數量。通過對擴增曲線的分析，可以獲得樣本中DNA或RNA的起始濃度。
二、熒光定量PCR儀的技術特點
2.1 實時定量檢測
qPCR儀器的最大特點是可以在PCR反應進行的同時實時監測熒光信號的變化，從而對目標核酸進行定量分析。這意味著在擴增過程結束時，科研人員無需再進行后續的電泳分析即可獲得定量結果。
2.2 高靈敏度與特異性
qPCR具有很高的靈敏度，可以檢測極低濃度的目標核酸，甚至可以檢測單拷貝的DNA或RNA。使用特異性探針如TaqMan探針時，特異性進一步提高，可以精確區分特定基因的突變和變異。
2.3 多重檢測能力
qPCR儀器通常配備多通道的熒光檢測系統，能夠同時檢測多個不同的熒光信號。這使得科研人員可以在同一反應中同時檢測多個目標基因（多重PCR），大大提高了實驗效率。
2.4 定量數據分析
熒光定量PCR儀配備專用的軟件，能夠自動生成擴增曲線、標準曲線，并進行定量分析。通過這些數據，科研人員可以計算樣本中目標核酸的起始量或相對表達量。
三、熒光定量PCR儀的應用領域
3.1 基因表達分析
qPCR是一種常用的基因表達分析工具。通過定量檢測不同條件下基因的表達水平，科研人員可以研究基因的調控機制、響應特定刺激的表達變化，以及基因在不同組織或發育階段的差異表達。
3.2 病原體檢測
qPCR技術廣泛應用于臨床診斷中的病原體檢測。由于其高靈敏度，qPCR能夠檢測樣本中極低含量的病毒、細菌或其他病原體，例如新冠病毒、流感病毒、結核分枝桿菌等。
3.3 基因突變檢測
qPCR還用于檢測基因突變和多態性，例如單核苷酸多態性（SNP）或癌癥中的關鍵基因突變。使用特異性探針，科研人員可以識別并量化樣本中基因突變的比例，為腫瘤研究和精準醫學提供支持。
3.4 拷貝數變異分析
qPCR還可以用于檢測基因組中的拷貝數變異（CNV），幫助科研人員了解基因擴增或缺失在疾病中的作用。
3.5 食品安全與環境監測
qPCR在食品安全和環境監測中有重要應用，用于檢測食品中的病原微生物、轉基因成分以及環境樣品中的污染物。其高靈敏度和快速反應能力使其成為這些領域中的重要工具。
四、熒光定量PCR儀的優勢
4.1 快速且高效
qPCR能夠在短時間內完成樣本的定量檢測，通常在1-2小時內完成整個反應。相比傳統的PCR加電泳檢測方法，qPCR直接在反應過程中進行熒光監測，減少了后續步驟，節省了實驗時間。
4.2 定量精確
qPCR能夠通過標準曲線精確測量樣本中的目標核酸量，這種精確的定量能力使其在基礎研究和臨床診斷中具有價值。
4.3 高靈敏度
qPCR的高靈敏度使其能夠檢測極低濃度的核酸樣本，適用于微量樣本或低拷貝數目標的檢測，例如早期病毒感染或基因突變分析。
4.4 多重分析
qPCR的多重檢測能力使得研究人員能夠在一個反應中同時檢測多個基因，大大提高了檢測效率并降低了實驗成本。
五、熒光定量PCR儀的局限性
5.1 成本較高
相比傳統PCR，qPCR儀器和試劑的成本較高。使用特異性探針（如TaqMan探針）時，成本尤其昂貴。
5.2 技術復雜性
盡管qPCR操作相對簡單，但對于復雜的實驗設計（如多重qPCR）和數據分析仍然需要較高的技術水平。此外，數據分析中的標準曲線建立和熔解曲線解析也需要經驗。
六、總結
熒光定量PCR儀是一種先進的生物分子檢測儀器，結合了PCR擴增和實時熒光信號監測的優勢，能夠實現對目標DNA或RNA的定量分析。由于其高靈敏度、快速檢測、定量精確和多重檢測能力，qPCR在基因表達分析、病原體檢測、突變分析、基因拷貝數檢測等領域有著廣泛的應用。盡管成本相對較高，qPCR憑借其技術優勢，已經成為生命科學、醫學診斷和環境監測中的關鍵工具。
