產(chǎn)品概述

【產(chǎn)品規(guī)格與保存】

【產(chǎn)品穩(wěn)定性】

1、所有的產(chǎn)品都需要避光保存；

2、所有產(chǎn)品一旦超過標簽注釋的有效期，必須放棄使用；

3、配制成專用培養(yǎng)基后，避光保存在2-8℃可存放3-4周；

4、為了更好的使用效果，請勿對試劑進行反復凍融。

【產(chǎn)品主要成份】

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的主要組成成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉鐵蛋白、胰島素、微量元素等。

【產(chǎn)品使用方法】

1、人間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基準備

將間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑(MSCGs)在2-8℃過夜融化，按1:100比例加入基礎培養(yǎng)基中，即成為間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基。

溫馨提示：間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基2-8℃避光條件下，可保存30天。若小量、多次使用，建議您將間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑(MSCGs)分裝后，保存于-20℃冰箱，可避免培養(yǎng)基不必要的浪費。

2、人間充質(zhì)干細胞復蘇（以T-75瓶為例）

①從冰箱中取出專用培養(yǎng)基，在生物安全柜或超凈臺中吸取適量（如T-75瓶：10-15mL)專用培養(yǎng)基沿上表面加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)瓶中，切勿沖到細胞培養(yǎng)瓶底面，即：細胞生長面。然后慢慢將細胞培養(yǎng)瓶平放，在37℃、恒溫CO2培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘后使用。

溫馨提示：請嚴格按照此步驟操作，否則可能會出現(xiàn)細胞培養(yǎng)瓶中細胞生長空白區(qū)域，即所謂的“生長空洞"。多數(shù)用戶使用的不是專用的預包被細胞培養(yǎng)瓶，而是普通的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，其表面環(huán)境并不利于無血清培養(yǎng)環(huán)境下的間充質(zhì)干細胞貼壁。37℃放置5-10分鐘，可讓培養(yǎng)基中的促貼壁物質(zhì)更好地與細胞培養(yǎng)瓶底部結合，使得間充質(zhì)干細胞的貼壁能力增強，降低“生長空洞"出現(xiàn)的概率。

②從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細胞，迅速將凍存管放入37℃水浴中，快速融解。

溫馨提示：盡可能避免水沒過管帽，以減少污染的風險；要快速完成細胞復蘇過程（盡量控制在1分鐘內(nèi)），融化過程時間過長，會造成復蘇后細胞活性較差。

③用70%-75%酒精消毒凍存管外壁，在生物安全柜或超凈臺中打開凍存管，用吸管/移液器將細胞凍存懸液緩慢移入裝有5-10mL細胞專用培養(yǎng)基的15mL離心管中（在這一過程請盡可能避免產(chǎn)生氣泡）。

溫馨提示：為了減少細胞損失，往細胞凍存管中加入1mL專用培養(yǎng)基，稍微吹打，用吸管/移液器將這1mL的細胞懸液吸入離心管中，再用吸管/移液器將離心管中的細胞輕輕吹打混勻。

④1200rpm離心5min，棄上清，加入2mL專用培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，按密度2×10⁴cells/cm²將細胞接種至步驟①中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中，添加細胞時，將細胞培養(yǎng)瓶豎立，細胞懸液直接加到底部，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面。

⑤輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿，使細胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

⑥24h后，更換新鮮的專用培養(yǎng)基（溫育至37℃）。

3、人間充質(zhì)干細胞傳代（以T-75瓶為例）

①在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到80-90%，即可傳代。

溫馨提示：細胞融合度請勿超過90%。很多傳代后的細胞大比例死亡，是由于傳代前細胞生長過密（融合度過高），導致細胞消化異常（細胞整片或成片脫落），加之隨后的不當操作（如用移液器反復吹打成片細胞使其成為單個細胞），此機械損失過程會嚴重損害細胞膜，引發(fā)大比例的細胞死亡；間充質(zhì)干細胞經(jīng)凍存后再次使用時，尤為明顯。

②預處理細胞培養(yǎng)瓶，處理方法同細胞復蘇中的步驟①。

③在生物安全柜或超凈臺中，棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入5-10mL PBS清洗細胞后棄去，再加入2mL 0.05%胰酶-EDTA消化細胞。

④在顯微鏡下觀察到細胞變圓時，立即加入5mL胰酶抑制劑終止消化。

⑤用移液器輕輕吹打瓶壁上還未專用脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞專用分散。

⑥將細胞懸液轉移至15mL離心管中，1200rpm離心5min。棄上清，加入2mL細胞專用培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，按細胞密度2×10⁴cells/cm²，將細胞接種至細胞傳代②步驟中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中，添加細胞時，將細胞培養(yǎng)瓶豎立，細胞懸液直接加到底部，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面。

⑦輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿，使細胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4、人間充質(zhì)干細胞凍存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待凍存的細胞，加入胰酶抑制劑終止消化并離心，重懸后進行細胞計數(shù)。

②1200rpm離心5min，棄上清。

③根據(jù)細胞計數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無血清凍存液（無血清凍存液可即拿即用或置于冰袋備用），調(diào)整細胞密度在1×10⁶cells/mL左右。

④輕輕地重懸細胞，將重懸均勻的細胞按等份加入到滅菌的凍存管中（需提前做好標記），旋緊凍存管蓋。

⑤迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃冰箱。

⑥過夜放置后，將細胞從-80℃冰箱轉移至液氮罐中長期保存。