Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環法 miRNA 第一連反轉錄試劑盒

miRNAFirstStandSynthesisKit 反轉錄試劑

目錄號:71505

產品內容

保存條件

-20℃保存，有效期 12 個月。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介

Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉錄酶，具有更強的延伸能力和穩定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時完成基因組清除與莖環法miRNA逆轉錄反應，操作方便快捷。逆轉錄產物可以用于后續的染料法或探針法熒光定量檢測。此方法特異性高只對成熟的miRNA進行反轉，不受其前體干擾，序列高度同源的miRNA也可精確區分。本試劑盒具有可從20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制備miRNA對應的第一鏈cDNA。

原理：本試劑盒采用莖環結構的逆轉錄引物與 miRNA 分子的3’端 結合，并在逆轉錄酶的作用下進行反應，獲得人為加長的 miRNA 第一鏈 cDNA。

引物的制備：

需要自己設計、合成用于反轉錄的頸環引物！

microRNA莖環引物及Realtime-PCR引物設計方法如下：

1. stem-loop RT引物設計：

基于通用的莖環結構，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6個堿基即可。通用莖環結構序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

例如設計miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用莖環序列后加上miRNA3’末端的6個堿基的反向互補序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。

2. realtime 上游引物設計：

miRNA序列除去3’端6個堿基 的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設計 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物設計好后，需要通過預試驗檢測引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將PCR產物進行電泳檢測產物是否單一（產物長度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）

操作步驟： (以20 μl反應體系為例)

1．莖環法反轉錄體系的配制

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：(使用前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。)

2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進行逆轉錄反應。

25℃孵育 5 min 后， 42℃孵育 20 min，85°C 加熱 5 sec，失活 RTase 和 dsDNase，終止反應。

3．合成的cDNA反應液可放置于-20℃保存，也可以直接進行下游PCR或者熒光定量qPCR檢測。

注意事項：

1. 在反應中使用的total RNA 必須含有小分子RNA 。

2. 此過程也可以使用小分子RNA， miRNA無法直接用分光光度計定量，建議加入量為2μl ~5μl?？筛鶕康?/span>miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。

3.  5 × miRT Reaction Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導致損失，用前請點甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。可以每次按照3.6-3.8μl使用，也不影響使用效果。

按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(貨號P501)進行qPCR。

注：按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時，可以根據實際情況選擇使用量，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA模板易導致非特異性擴增，可根據所檢測miRNA的豐度適當的稀釋cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發現有非特異擴增條帶，或者融鏈曲線顯示有非特異擴增，往往提示cDNA模板過量，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。

miRNAFirstStandSynthesisKit 反轉錄試劑