目前針對重組蛋白質藥物中雜質蛋白質的 分類主要包含兩種： 1) 產品相關雜質 （Product-related impurities）；2) 過程相關雜 質（Process-related impurities）[1] 。其中產品 相關雜質主要是在生產和儲存過程中產生， 包括母藥降解產物、聚合物、翻譯后修飾 （脫氨、糖基化、二硫鍵錯配、氧化等）， 可通過肽圖及修飾、寡糖分析，二硫鍵解析 進行分析。而過程相關雜質主要包括宿主細 胞蛋白質（Host cell protein，HCP）、蛋白質 純化中用到的Protein A等。
重組蛋白質藥物一般由哺乳動物細胞表達 生產，生物制品中殘留的宿主細胞蛋白質 (HCP)作為外源蛋白質可能在不同程度上引發 機體的免疫應答，終導致過敏反應或其他 不良反應，因此必須建立合適的檢測HCP的方 法監控生物制品的質量。認識殘留HCP的風險、 建立合適的殘留HCP檢測方法、控制生物制品 的質量顯得尤為必要。 目前，上針對HCP 的殘留*尚無統一標準，生物制藥公司采 用風險控制(risk management)來設置HCP的殘 留*[2] 。美國 FDA規定, 用一種靈敏度較高 的方法檢測藥品中的 HCP, 其含量應該低于檢 測限 ( 通常小于100 ppm) [3] 。國內來看，《中 華人民共和國藥典》2010年版三部規定CHO細 胞殘余蛋白質占總蛋白質含量的0.05%以下[4] 。 這提示研發單位在這個研發周期中需要將HCP 殘留作為重要的質量控制項目。目前針對HCP 分析的主要難點在于成分復雜，可能包含上 千種殘留蛋白質，其動態范圍為4至5個數量 級；另外，相對重組蛋白質藥物，HCP含量較低（ppm級別），對檢測方法的靈敏度和動態 范圍要求較高。
宿主蛋白質檢測方法不僅是保證生物制品 安全有效的關鍵, 也是生產過程控制和工藝優 化的重要參數。目前, 宿主蛋白質檢測方法常 用的HCP分析方法有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、二維(2D)電泳、高 效液相層析(HPLC)、蛋白質印跡(Western blot) 和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等[5] 。其中，ELISA 仍然是相對應用較廣泛的HCP檢測方法, 主要 是由于其技術相對簡單、靈敏度較高，并可 提供數字化的定量結果，便于設定檢測限度 和建立技術規范。但是ELISA方法也存在一系 列的缺點，比如動態范圍較窄（<100），存 在抗體交叉反應帶來的結果誤判，且開發周 期長, 費用高 (>$100K)、失敗風險高，商品化 的試劑盒無法涵蓋所有過程特異性的HCP無法 發現由于工藝改變等引起的新出現的HCP蛋白 質的等問題。
與傳統的ELISA方法相比，液相色譜質譜聯用（LC-MS）方法具有開發時間短（只需幾 周），可特異性地對所有HCP進行確證和定量， 對所有雜質蛋白質無偏性檢測，且方法動態 范圍高（可達6個數量級），方法調整快等優 點。因此液質聯用分析HCP已經成為業內關注 的熱點。但是，HCP實驗面對的是蛋白質種類 眾多、復雜、樣品豐度差異巨大的分析對象， 并且需要獲得蛋白質定性與定量的完整信息， 因此對質譜硬件要求*。但從另一方面看， HCP所面臨的復雜體系蛋白質鑒定與定量任務，
雜蛋白質組學中的大規模蛋白質鑒定與定量 工作的分析任務*一致。甚至，在蛋白質 組學迅猛發展的十年間，實驗人員已經對更 為復雜的樣本體系，如血漿、肝臟、腦、尿 等進行了深入分析。因此，*可以借鑒蛋 白質組學積累的豐富的質譜使用經驗。
在蛋白質組學研究中，靜電場軌道阱 (Orbitrap) ，是業內*的分辨率高、質量精 度準、靈敏度高、動態范圍寬的質量分析器。 其中Q Exactive是四極桿和orbitrap的組合質譜 平臺，其不但具有異常強大的蛋白質鑒定能 力[6] ，而且Q Exactive還*顛覆了傳統對高 分辨質譜定量能力不足的認識，次在一 個儀器平臺同時兼顧了的定性與定量性 能。而且其小巧的體積，簡單的操作，維護 便捷，使得高分辨質譜能夠進入更多的實驗 室。
圖1為單抗產品的HCP液質分析策略示意 圖。實驗分為兩個部分。首先是HCP的鑒定與 初步定量。在這一步，為了降低實驗難度， 不需要使用已經完成所有純化步驟的產品作為樣品，而是使用上游的半成品分析。其中， 剛完成離心富集，以及剛經過Protein A純化得 到的中間產品是較為理想的分析對象。這是 因為，這兩個步驟的樣品中，HCP的相對豐度 較成品高，而利于HCP的鑒定發現。當獲得 HCP及其特征肽段的列表后，就可以使用這些 信息進入第二步驟——HCP監控分析。在這一 步，目標分析物為終產品，并采用以對目 標蛋白質進行定量為目標的定量質譜法— —選擇離子監控質譜法或平行反應監測質譜法。
在HCP鑒定發現步驟中，主要采用DDA （Data Dependent Acquisition）質譜法進行蛋 白質的鑒定，一級采用全掃描模式，二級譜 圖根據一級譜圖中不同質荷比離子的強度信 息（Top N）依次進行觸發。Q Exactive采集速 度高達12Hz，具有蛋白質鑒定能力。 Matthew等以酵母細胞為分析對象，在四小時 的分析時間內，Q Exactive可同時鑒定到4,206 個蛋白質，動態范圍達5個數量級，并且可鑒 定到豐度極低的蛋白質 （ less than 50 copies/cell）[7] 。其高通量、寬動態范圍、高 靈敏度的特點非常適合于重組蛋白質藥物中雜質蛋白質的高通量定性要求。另外，可利 用一級質譜圖中雜質蛋白質特征肽段的峰面 積進行相對定量，這樣就可同時完成雜質蛋 白質的鑒定和定量。定量方法如iBAQ蛋白絕 對定量算法。此方法將所有蛋白多肽的質譜 響應強度加權平均，并利用48種標準濃度蛋 白測定的校正曲線自動校準，終獲得樣本 中蛋白的含量，動態范圍可達6個數量級 相應工作已于2011年發表在了Nature主刊中[8] 。 免費的MaxQuant蛋白分析軟件內置了iBAQ定 量功能，可以輕松、地獲得目標蛋白在 樣品中的相對豐度。
在殘留宿主細胞蛋白質分析的第二步（對 已鑒定的HCP進行目標監控與定量）實驗中， 平行反應監測法（PRM）的表現更為突出。 PRM法是基于Q Exactive基礎的目標蛋白質定 量方法。它不但具有高靈敏度、寬線性范圍、抗基質噪音能力強、同時定性定量、方法設 置簡單、無需方法優化等性能優點[9] 。加之僅 在一個Q Exactive平臺就可完成HCP的全部分析 任務。因此還具有了高性價比的經濟優勢。 在HCP的質譜分析實例中，Katrin等人使用 Orbitrap型質譜監控重組蛋白質藥物純化過程 中宿主蛋白質的變化，并在終藥物中鑒定 到多種低豐度的宿主蛋白質,對蛋白質純化方 法的優化具有重要參考意義[10] 。
綜上，Q Exactive在一個儀器平臺上實現 了重組蛋白質藥物宿主細胞蛋白質的發現鑒 定及定量監測要求，并與專業蛋白質解析軟 件組成蛋白質藥物雜質蛋白質分析完整解決 方案，技術流程簡單、成熟、通過了大量的 高水平研究與實踐，非常適合生物制藥企業 在研發周期中將其作為殘留HCP質量控制的質 譜分析平臺。
更多信息請點擊：液相色譜質譜聯用（LC-MS）
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