一、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析、分子篩層析和凝膠過濾。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，其內部具有很細微的多孔網狀結構。凝膠層析的機理是分子篩效應。凝膠顆粒在合適溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中大分子不能進入凝膠內部而沿凝膠顆粒間的空隙先流出柱外，而小分子可以進入凝膠顆粒內部的多孔網狀結構，流速緩慢，以致后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質按順序分離開。
目前使用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和瓊脂糖與葡聚糖組成的復合凝膠。本實驗用的是葡聚糖凝膠，是由多聚葡萄糖與環氧化氯丙烷通過交聯反應制成的有孔顆粒狀凝膠。
根據凝膠層析的原理，對同一類型化合物，其洗脫特征與組分的相對分子質量有關，流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，相對分子質量大者走在前面。通常以對相對分子質量的對數作圖可得一曲線，稱“選擇曲線”，曲線斜率是凝膠性質的一個重要特征，在一定范圍內，曲線愈陡分級愈好。在測定末知物的相對分子質量時，以使用曲線的直線部分為宜。
二、實驗用品
（一）器材
（1）層析柱：1.1×100cm。
（2）核酸蛋白質檢測儀或紫外分光光度計。
（3）自動部分收集器，恒壓瓶，口瓶。
（二）試劑
（1）Sephadex G-75。
（2）5% Ba(AC)2。
（3)洗脫液：0.025mol/L Kcl０.２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸溶液。
（4）藍色葡聚糖－２０００（２mｇ／ｍｌ）。
（5）Ｎ－乙酰酪氨乙酯（１～２ｍｇ／ｍｌ）。
（6）標準蛋白質混合液（各２～３mg／ｍｌ，用Kcl－乙酸溶液配制）；包括牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白酶原和結晶牛胰島素，均需層析純。
（三）材料
牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白原A，結晶牛胰島素，以上材料均需層析純。
三、實驗程序
（一）操作方法
1.一般操作方法
（１）凝膠的選擇和處理：凝膠顆粒大小均勻。對于顆粒不均勻的凝膠，可將其懸浮于大體積的水中，讓其自然沉降，在一定時間之后，用傾瀉法除去懸浮的過細顆粒。
將稱好的凝膠干粉傾入過量的洗脫液中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。溶脹時間因凝膠交聯度不同而異。為了縮短溶脹時間，殺死細菌和霉菌，排除凝膠內氣泡，可在沸水浴上加熱。
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