動物細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 動物細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑是一種旨在通過差速離心技術從動物細胞中分離出各種正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內側外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）組分的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種動物、人體細胞的膜性囊泡的制備。其制備物產量高，可以被用于膜通道、信號傳導機制、膜蛋白分布等研究。產品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度俱佳。

技術背景

膜性囊泡（membrane vesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內側外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）。正常外向膜性囊泡是通過去除細胞漿內容物，使之失去細胞內在的代謝系統，同時保持質膜的原始位相，有利于提供適合的底物，不會受到降解和代謝，建立動力機制，進行轉運或攝入研究，例如微粒體組分用于V型ATP酶研究、線粒體組分用于F型ATP酶研究。而內側外翻膜性囊泡是通過裂解細胞和細胞器后，質膜重新閉合形成內側面外翻的囊泡狀結構，廣泛用于原發性轉運系統的研究。 

產品內容

 清理液（Reagent A）    200毫升

 平衡液（Reagent B）     60毫升

 保存液（Reagent C）     20毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存 保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞處理所需的培養基

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃超速離心機：用于分離膜性囊泡

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

一、正常外向膜性囊泡分離（線粒體和微粒體）

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預冷的 平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到2個新的1.5毫升離心管，同時保留沉淀顆粒
• 加入500微升 保存液（Reagent C）到沉淀顆粒管――此為線粒體RSOV組分（注意：可用于F型ATP酶研究）
• 將含有上清液的2個1.5毫升離心管放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入500微升 保存液（Reagent C）――此為微粒體RSOV組分（注意：可用于V型ATP酶研究）
• 移取10微升進行蛋白質定量測定（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃冰箱里保存

二、內側外翻膜性囊泡分離（質膜分離）

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預冷的 平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 保存液（Reagent C）――此為質膜RSOV組分（注意：可用于P型ATP酶研究）
• 連續－70℃至37℃凍融4次――此為質膜IOV組分
• 移取10微升進行蛋白質定量測定（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）進行IOV組分純化（建議使用  IOV膜性囊泡高質純化試劑盒－GMS10170）

注意事項

• 本產品為20次（5 X 10⁷動物細胞）操作
• 所有操作均須在4℃或以下狀態進行
• 建議使用足夠的樣品量
• 通常5 X 10⁷動物細胞的微粒體組分含量為50毫克蛋白，線粒體組分含量5毫克蛋白，100毫克質膜

5． 質膜IOV組分為粗提分離產物，其中含有RSOV和未予閉合的質膜不等，如果需要獲得95％以上的高純度的IOV，建議使用  IOV膜性囊泡高質純化試劑盒－GMS10170

6． 純化的樣品避免反復凍融  

• 本公司提供系列離子膜通道轉運功能（transport/uptake）分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離組分維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶