全組織NADH心肌黃酶活性染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 全組織NADH心肌黃酶活性染色試劑是一種旨在使用人工電子受體染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（MTT），受到NADH心肌黃酶催化還原，產生不溶性藍黑*素沉淀，來分析全組織樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心改良傳統方法、成功實驗證明的。主要適用于各種動物組織的心肌黃酶活性定性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

心肌黃酶（Diaphorase），又稱為硫辛酰胺脫氫酶（lipoamide dehydrogenase），黃遞酶，二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期從豬心肌中提取，產品又呈現熒光的黃綠色蛋白質，故被稱為心肌黃酶。分子量102000至110000。NADH心肌黃酶直接和黃素蛋白（Flavoprotein）反應，釋放出氫原子，將氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），傳遞氫原子給氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作為電子供體，還原人工電子受體，例如染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），產生不溶性甲暨色素，由此用于鑒別內臟神經組織等各種動物組織。

產品內容

 清理液（Reagent A）  250毫升

 染色液（Reagent B）   30毫升

 反應液（Reagent C）    3毫升

 固著液（Reagent D）   30毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反應液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于反應孵育

光學顯微鏡：用于染色后切片觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取2.7毫升 染色液（Reagent B）到新的15毫升錐形離心管，加入300微升 反應液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

• 準備1個6孔細胞培養板
• 放進新鮮切除的動物組織樣本（注意：建議組織大小為0.5厘米厚，1厘米長；如果過大，刀切處理一下）
• 將組織壓平
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升 染色工作液，浸沒整個組織
• 放進37℃培養箱，孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心加上3毫升 清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟9至10二次
• 小心加入3毫升 固定液（Reagent D），浸沒整個組織
• 在室溫下孵育15分鐘
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 在室溫下孵育15分鐘
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟15至17二次
• 后續石蠟切片（6微米厚）或冰凍切片（10微米厚）
• 在光學顯微鏡下觀察和計數：表達NADH心肌黃酶的組織細胞為陽性組織細胞，呈現藍黑色

注意事項

• 本產品為10次操作
• 操作時，須戴手套
•  反應液（Reagent C）避免反復凍融
• 陰性對照時， 染色工作液不含有 反應液（Reagent C）
• 心肌組織可以用于陽性對照
• 用戶根據實際需求，按比例配制試劑用量
• 整個操作，在避光狀態下進行
• 染色孵育時間，根據樣品和酶活性強弱調整，通常為60分鐘
• 全組織染色存在其染色不均勻、組織內部染色滲透困難等局限
• 染色后的后續處理的切片樣品可以長期保存，同樣須避免光照
• 染色參考圖像見下圖

• 本公司提供NADH心肌黃酶活性NBT染色試劑產品
• 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰