精子細胞氧化應激活性氧（ROS）細胞流式儀檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 精子細胞氧化應激活性氧（ROS）細胞流式儀檢測試劑是一種旨在使用透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在細胞氧化條件下，產生熒光，來定量檢測精子細胞內活性氧族的生成和增加的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于動物和人體精子細胞的活性氧族的檢測。可以被用于細胞凋亡、衰老、代謝和營養學，以及發育生物學（男性不育）等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過細胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產生熒光。據此測定精子細胞內活性氧族的濃度。 

產品內容

 高純液（Reagent A）    毫升

 低純液（Reagent B）    毫升

 保存液（Reagent C）    毫升

 染色液A（Reagent D）    微升

 染色液B（Reagent E）    微升

產品說明書   1份

保存方式

保存 高純液（Reagent A）和 低純液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液A和B（Reagent D和E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞培養箱：用于樣品孵育

微型臺式離心機：用于樣品操作

血細胞計數器：用于細胞計數

細胞流式儀：用于分析染色的精子細胞

實驗步驟

• 樣品預處理

• 移取2毫升新鮮收集（48小時內）的精液到2毫升離心管
• 放進37℃培養箱孵育20分鐘（注意：可以離心后加入 保存液（Reagent C）后，直接染色檢測）——此為純精液精子細胞
• 準備一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升 高純液（Reagent A）
• 小心加入xx毫升 低純液（Reagent B）在上述 高純液（Reagent A）的上面（注意：避免震蕩）
• 小心加入xx毫升精液在上述 低純液（Reagent B）的上面（注意：避免震蕩）
• 放進臺式離心機離心20分鐘，速度為300g
• 小心移取 高純液（Reagent A）和 低純液（Reagent B）交界面上的精子細胞——此為不成熟精子細胞（注意：如果檢測不成熟精子細胞，可以加入 保存液（Reagent C）保留）
• 小心移取管底精子細胞顆粒群到新的1.5毫升離心管——此為成熟精子細胞
• 加入xx毫升 保存液（Reagent C），混勻成熟精子細胞顆粒群
• 充分混勻后，在血細胞計數器上進行精子細胞計數
• 調整精子細胞數為1 X 10⁶/毫升
• 放進37℃培養箱里備用（1小時內）

• 細胞流式儀分析

• 加入xx微升 染色液A（Reagent D）到上述制備的500微升1 X 10⁶/毫升的精子細胞，混勻
• 加入xx微升 染色液B（Reagent E）到上述制備的500微升1 X 10⁶/毫升的精子細胞，混勻
• 室溫（25℃）下孵育40分鐘，避免光照
• （選擇步驟）放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• （選擇步驟）加入xx毫升 保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 即刻進行細胞流式儀雙通道分析：觀察至少10000個精子細胞以上

• 細胞流式儀檢測純精液樣品精子細胞氧化應激活性氧參考圖像如下

注意事項

• 本產品為20次（500微升體系）操作
• 操作時須戴手套
• 用戶根據需要進行純精液精子細胞、不成熟或成熟精子細胞的檢測分析
• 如果純精液樣品中含有1 X 10⁶白細胞/毫升，不宜進行純精液精子細胞活性氧檢測
• 樣品檢測前，建議在血細胞計數器上進行精子細胞計數
• 精子細胞計數時乘上稀釋倍數10⁴。標準血細胞計數器（Hemocytometer）的計算方法是：

1毫米方塊的細胞計數X 10⁴（稀釋倍數）＝實際細胞數/毫升

• 染色完成后，即刻進行檢測分析，否則影響檢測
• 使用向前散射光（forward angle light scatter）選擇性排除精子細胞殘渣和精子細胞集聚顆粒
• 建議使用100精子細胞/秒流速為佳
• 本產品也可用于凍存精子細胞的檢測分析
• 正常純精液樣品的精子細胞活性氧陽性率較低，通常為小于4%
• 本公司提供系列發育生物學相關檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰