MB50018.1.1 v.A

 細胞脊髓過氧化酶（MPO）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞脊髓過氧化酶（MPO）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過脊髓過氧化酶反應系統中底物還原性愈創木酚，經過過氧化反應后，產生的吸光值變化，即采用比色法來測定細胞樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物或人體細胞裂解萃取樣品脊髓過氧化酶（MPO）的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

脊髓過氧化酶（myeloperoxidase；MPO；EC1.11.1.7）是一種高度陽離子糖基化血紅素蛋白（hemeprotein），由兩個雙體通過二硫鍵連接在一起。每個雙體由一個重鏈亞體（53kd）和一個輕鏈亞體（15kd）構成。其總分子量為144kd。脊髓過氧化酶存在于多形核白細胞的嗜天青顆粒（azurophilic granule）中，尤其在中性白細胞和單核細胞中。脊髓過氧化酶通過使用過氧化氫，氧化芳香類化合物，產生自由基，達到抗菌作用。脊髓過氧化酶可以催化氯離子的過氧化作用，生成非自由基次綠酸（hypochlorite）。脊髓過氧化酶參與機體的天然防御機制，但是一旦失控，則會產生組織損害和炎癥反應。脊髓過氧化酶的活性檢測可以用來評價和診斷心血管疾病狀況。基于底物還原性愈創木酚（guaiacol或2-o-methoxyphenol），作為氫的供體，在過氧化氫的參與下，受到脊髓過氧化酶的過氧化催化，成為氧化性愈創木酚，而發生吸光值的增高（470nm波長），來定量測定脊髓過氧化酶的活性。脊髓過氧化酶反應系統為：

myeloperoxidase

2 （reduced guaiacol） +  H2O2       →      2 （oxidized guaiacol）  +  2H2O

產品內容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 緩沖液（Reagent C）  20毫升

 底物液（Reagent D）   1毫升

 氧化液（Reagent E）   1毫升

 陰性液（Reagent F）   500微升

產品說明書      1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）和 底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應液配制以及樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養箱：用于孵育反應物

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1；同時使用 裂解液（Reagent B）作為空白對照）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長470nm，并置零  
• 測讀開始前，移取100微升 底物液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入100微升 氧化液（Reagent E），輕柔混勻后，標記為 反應工作液，放在暗室里
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應工作液
• 加入100微升 陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻
• 放進25℃培養箱里孵育5分鐘
• 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照 

• 樣品測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應工作液
• 加入100微升上述準備的樣品（100微克蛋白總量）
• 上下傾倒數次，混勻 
• 放進25℃培養箱里孵育5分鐘
• 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品讀數 

• 計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 1.0（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 26.6（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾愈創木酚/分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反應工作液
• 分別加入25微升 陰性液（Reagent F）或待測樣品（50微克蛋白總量）到相應孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 放進25℃培養箱里孵育5分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得背景和樣品讀數
• 活性計算：

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 26.6（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（稀釋后樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾愈創木酚/分鐘

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定吸光值讀數越高，表明酶活性越高
• 反應測定值隨著時間增加，吸光讀數逐漸增高；如果酶活過低，反應孵育可以持續10至20分鐘，甚至60分鐘
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品容量
• 脊髓過氧化酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.0條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾愈創木酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列氧化酶類分析技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感