MB50379.2 v.A

 組織甘油激酶（Glycerol kinase）活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 組織甘油激酶（Glycerol kinase）活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用甘油激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法測定樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物、人體組織裂解懸液樣品的甘油激酶的性活性檢測。可用于脂類代謝、能量代謝、蛋白組學、病理生理學等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

甘油激酶（glycerol kinase；GK；EC2.7.1.30），又稱為ATP甘油-3-磷酸轉移酶（ATP:glycerol 3-phospho transferase），廣泛存在于生物界。甘油激酶催化由ATP提供的磷酸基團，轉移到甘油分子上的反應，產生磷酸甘油。哺乳動物中，甘油激酶參與糖和脂類代謝的交接部位的反應；微生物中，甘油激酶幫助利用甘油分子，作為微生物生長所需的碳源。臨床上常用于定量檢測人體內甘油水平。通常脂肪細胞（adipocyte）缺乏甘油激酶，由甘油三酯降解產生的甘油分子，由血液轉運到肝臟后，甘油激酶參與脂類分解（lipolysis）。基于底物甘油分子，在ATP的參與下，受到甘油激酶的磷酸化，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析甘油激酶活性。其反應系統為：

glycerol kinase

Glycerol  +  ATP   →    ADP  +  α-glycerophosphate

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

產品內容

 清理液（Reagent A）  60毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 緩沖液（Reagent C）  20毫升

 反應液（Reagent D）      2.5毫升

 陰性液（Reagent E）     2毫升

 底物液（Reagent F） 500微升

產品說明書      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融； 反應液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

培養箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 反應液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的500微升 裂解液（Reagent B） 
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－ MB30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

• 準備好待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數11次（共10分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent D）
• 加入20微升 底物液（Reagent F）
• 放進25℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升 陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 樣品活性測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent D）
• 加入20微升 底物液（Reagent F）
• 放進25℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：100微克總蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 計算樣品活性

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 10（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

• 酶標板測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中
• 分別加入25微升 反應液（Reagent D）
• 分別加入5微升 底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入25微升 陰性液（Reagent E）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標板
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數
• 活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

注意事項

• 本產品為21次操作，包括1次背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 避免使用磷酸緩沖溶液處理樣品
• 加入樣品后3秒內即刻光譜測定
• 初始反應可能較為遲緩；測定值由高到低變化；測定可以持續10分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光譜測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 MB30030.1）
• 甘油激酶活性單位定義：在25℃溫度下，pH 8.9條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列激酶類技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確