MB10169.3 v.A

  真菌/酵母細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  真菌/酵母細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑是一種旨在通過差速離心技術從真菌/酵母細胞中分離出各種正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內側外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）組分的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種野生型或培養真菌/酵母細胞的膜性囊泡的制備。其制備物產量高，可以被用于膜通道、信號傳導機制、膜蛋白分布等研究。產品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度俱佳。

技術背景

膜性囊泡（membrane vesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內側外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）。正常外向膜性囊泡是通過去除細胞漿內容物，使之失去細內在的代謝系統，同時保持質膜的原始位相，有利于提供適合的底物，不會受到降解和代謝，建立動力機制，進行轉運或攝入研究，例如微粒體組分用于V型ATP酶研究、線粒體組分用于F型ATP酶研究。而內側外翻膜性囊泡是通過裂解細胞和細胞器后，質膜重新閉合形成內側面外翻的囊泡狀結構，廣泛用于原發性轉運系統的研究。 

產品內容

  清理液（Reagent A）    毫升

  平衡液（Reagent B）    毫升

  保存液（Reagent C）    毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存  保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃超速離心機：用于分離膜性囊泡

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

一、正常外向膜性囊泡分離（線粒體和微粒體）

• 準備好50毫升新鮮真菌/酵母樣品
• 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細胞/毫升；總量為5 X 10⁸細胞） 
• 轉移到預冷的50毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）碾碎細胞成粉末（注意：切莫使細胞凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到2個新的1.5毫升離心管，同時保留沉淀顆粒
• 加入xx微升  保存液（Reagent C）到沉淀顆粒管――
• 將含有上清液的2個1.5毫升離心管放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入xx微升  保存液（Reagent C）――
• 移取10微升進行蛋白質定量測定（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃冰箱里保存

二、內側外翻膜性囊泡分離（質膜分離）

• 準備好50毫升新鮮真菌/酵母樣品
• 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細胞/毫升；總量為5 X 10⁸細胞） 
• 轉移到預冷的50毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（*速度）碾碎細胞成粉末（注意：切莫使細胞凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液 
• 加入xx微升  保存液（Reagent C）――
• 連續－70℃至37℃凍融4次―― 
• 移取10微升進行蛋白質定量測定（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）進行IOV組分純化（建議使用   IOV膜性囊泡高質純化試劑盒－GMS10170）

注意事項

• 本產品為20次（50毫升菌液：1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞）操作
• 所有操作均須在4℃或以下狀態進行
• 建議使用足夠的樣品量
• 通常5 X 10⁸細胞的微粒體組分含量為50毫克蛋白，線粒體組分含量5毫克蛋白，100毫克質膜

5． 質膜IOV組分為粗提分離產物，其中含有RSOV和未予閉合的質膜不等，如果需要獲得95％以上的高純度的IOV，建議使用   IOV膜性囊泡高質純化試劑盒－GMS10170

6． 純化的樣品避免反復凍融  

• 本公司提供系列離子膜通道轉運功能（transport/uptake）分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離組分維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶