MB50798.1 v.A

  細胞P300/CBP組蛋白乙酰轉移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）

定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞P300/CBP組蛋白乙酰轉移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法（340nm）定量檢測試劑是一種旨在通過通用底物H3多肽，在敏感性抑制劑存在與否的情況下，通過P300/CBP的作用，將乙酰輔酶A上的乙酰基團，轉移到多肽分子上的過程中，釋放出巰基輔酶A，進而使用α-酮戊二酸脫氫酶反應系統中伴隨的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的還原反應， 即采用光度法測定其還原后峰值的變化，來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或*純化酶樣品中P300/CBP HAT的特異活性檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

核小體（nucleosome）是染色質的小結構單位，由組蛋白H2A-H2B雙體和H3-H4雙體構成的組蛋白八體結構（octamer），外層涵蓋146堿基DNA。其結構中組蛋白N末端為游離狀態，且高度進化保留，在特定氨基酸部位發生諸如甲基化、乙酰化、磷酸化修飾，以改變其電荷和功能。組蛋白上特定賴氨酸殘基的ε氨基基團的乙酰化通過組蛋白乙酰轉移酶（Histone Acetyltransferase；HAT；EC2.3.1.48）催化產生，具有表觀遺傳學的調節作用，達到染色體重構（remodeling），染色質松弛打開，促使基因轉錄。其功能異常將導致腫瘤、神經退行性疾病、AIDS和炎癥。組蛋白乙酰轉移酶，又稱為賴氨酸乙酰轉移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，細胞核內的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和細胞漿內的B型，例如Hat1。其又分成六類：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、ATF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），還包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受體共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（transcriptional factor IIIC）等。其中P300/CBP家屬中包括P300、CBP、和P300/CBP相關因子（P300/CBP Associated Factor；PCAF），這是個發現的組蛋白乙酰轉移酶，成為結構、機制和功能研究的代表。P300（又稱為KAT3B），E1A腫瘤結合蛋白和CBP（又稱為KAT3A），cAMP反應元素結合蛋白（cAMP Responsive Element-Binding Protein；CREB）是全面性轉錄共激活因子（global transcription coactivator），位于核內，屬于旁系同源（paralogue）蛋白，功能相等，序列相似，相同的結構域（包括核受體結合結構域、鋅指（zinc finger）結構域、溴區結構域（bromodomain）、內部大乙酰轉移酶結構域等），具有內生性乙酰轉移酶活性，乙酰化組蛋白和非組蛋白，與300多個DNA結合性轉錄因子、病毒轉化因子、核受體、信號分子等反應、其功能在于調節細胞周期和細胞分化、控制細胞生長和凋亡、整合多種轉錄水平信號依賴性通路（例如G蛋白通路）、修正基因表達、DNA修復和復制、蛋白間反應和蛋白穩定性，作用于胚胎發育尤其是器官生成，以及調節造血干細胞、神經突觸活性和長期記憶形成等。P300和CBP異常，會導致腫瘤發生和發展、糖尿病、哮喘、髓細胞白血病（myeloid cell leukemia）、闊拇指巨趾綜合征（Rubinstein-Taybi syndrome）。基于底物H3組蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala- Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH₂ （H3組蛋白N末端5至23氨基酸殘基），在P300/CBP敏感性抑制劑C646存在與否的情況下，通過P300/CBP的作用，將乙酰輔酶A上的乙酰基團，轉移到多肽分子上，由此產生乙酰化多肽和巰基輔酶A（CoA-SH），進而通過α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase）反應系統中，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析P300/CBP組蛋白乙酰轉移酶的特異活性。其反應系統為：

產品內容

  裂解液（Reagent A） 毫升

  分離液（Reagent B） 毫升

  清理液（Reagent C） 毫升

  萃取液（Reagent D） 毫升

  緩沖液（Reagent E）      毫升

  反應液（Reagent F）      微升

  底物液（Reagent G）      微升

  專性液（Reagent H）      微升

  陰性液（Reagent I）      微升

產品說明書     1份

保存方式

保存  反應液（Reagent F）、  底物液（Reagent G）和  專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細胞樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于反應和光度分析的容器

酶標儀或分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心抽去培養液
• 小心加入10毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  裂解液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管 
• 強力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent C）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預冷的  萃取液（Reagent D），混勻
• 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒：功率100瓦，10秒一次，間隔2分鐘，重復2次（注意：保持在冰槽里）
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－   30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零 
•   緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度

• 樣品總活性測定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent I）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，獲得背景讀數（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品總活性測定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測樣品（注意：50微克核蛋白；樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，獲得樣品總活性讀數（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品非特異活性測定

• 加入xx微升  緩沖液（Reagent E）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent F）
• 加入xx微升  底物液（Reagent G）
• 加入xx微升  專性液（Reagent H）
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測樣品（注意：50微克核蛋白；樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，獲得樣品非特異活性讀數（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 計算樣品實際活性

• 總活性和非特異活性

• 樣品特異活性

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品處理時，避免使用巰基乙醇、DTT等
• 孵育反應完成后即刻進行光度測定
• 測定值由低到高變化
• 測定值讀數越高，表明酶活性越高
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒   30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• P300/CBP組蛋白乙酰轉移酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠還原1微摩爾NAD所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組蛋白乙酰轉移酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感