MB50047.3.1 v.A

  細胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

  細胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過二肽化合物底物z-FR-AMC，在組織蛋白酶L抑制劑的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光產物氨甲基香豆素，即采用熒光法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）的特異活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細胞器內，在酸性環境下激活，切離各種目標蛋白。根據其結構和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細胞內蛋白和細胞外蛋白通過內吞進行周轉中起著重要作用，同時也是啟動和傳遞細胞凋亡信號的替代機制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉化為β-淀粉樣蛋白斑點（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉移、骨再吸收、細胞內或分泌性調節蛋白周轉、卵細胞成熟、細胞凋亡等方面具有重要作用。細胞間接觸和細胞外基質成分影響43kd組織蛋白酶原L轉化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應。組織蛋白酶B異常，將導致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激發波長360nm；散發波長460nm），來定量測定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應系統為：

CATHEPSIN B

z-FR-AMC       →          z-FR  +   AMC

             Z-FY(t-Bu)-DMK

產品內容

  清理液（Reagent A） 120毫升

  裂解液（Reagent B）  10毫升

  緩沖液（Reagent C）   2毫升

  底物液（Reagent D）   500微升

  標準液（Reagent E）  50微升

產品說明書      1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）和  標準液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或比色皿：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實驗步驟

• 樣品制備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升  裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發波長360nm，散發波長460nm，并置零 
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入25微升  緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取50微升  標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取25微升1號管稀釋的  標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取25微升2號管稀釋的  標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取25微升3號管稀釋的  標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

• 移取70微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升上述配制的標準液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟1至6四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取70微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升待測樣品（50微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度

• 計算樣品實際活性

[根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取70微升  緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入20微升  底物液（Reagent D）
• 分別加入10微升上述配制的標準液或待測樣品（50微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度
• 樣品實際活性計算：

根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準曲線測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融  
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對照或陰性對照
• 組織蛋白酶B單位活性定義為：在37℃，pH 5.5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組織蛋白酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感