細(xì)菌賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  細(xì)菌賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)單肽化合物底物acetyl-Lys-pNA，受到賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解，釋放出黃色對(duì)硝基苯胺，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種牙周炎細(xì)菌裂解萃取液、培養(yǎng)上清、牙周縫隙液體等樣品賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

牙齦卟啉菌蛋白酶（gingipain）是一種胰蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase），常見(jiàn)于細(xì)菌表面、細(xì)胞外基質(zhì)囊泡內(nèi)以及細(xì)菌培養(yǎng)上清，為膜結(jié)合型和細(xì)胞外分泌型，有2個(gè)類型：精氨酸依賴特異性（arginine specific；Rgp）和賴氨酸依賴特異性（lysine specific；Kgp）。前者有2個(gè)同工酶：RgpA和RgpB：RgpA又分成HRgpA、RgpA（cat）和mtRgpA；RgpB又分成RgpB和mtRgpB。牙齦卟啉菌蛋白酶也是一種毒力因子，為革蘭氏陰性厭氧細(xì)菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）、等多種細(xì)菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，使血液凝結(jié)和纖維溶解（fibrinolytic）通路，以及免疫系統(tǒng)失調(diào)，激活激肽釋放酶（kallikerin）和激肽（kinin）通路，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，活化基質(zhì)金屬蛋白酶和血小板，切離層粘連蛋白（laminin）、纖連蛋白（fibronectin）、膠原蛋白等，間接促成牙周組織浸入和破壞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、CAM分子分解和細(xì)胞脫離（失巢凋亡anoikis），導(dǎo)致牙周病發(fā)生，甚至心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿茨罕默癥等。牙齦卟啉菌蛋白酶成為藥物靶標(biāo)。基于人工合成的單肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline；乙酰賴氨酰對(duì)硝基苯胺），受到賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解，釋放出黃色對(duì)硝基苯胺（405nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性。賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  裂解液（Reagent A）  毫升

  緩沖液（Reagent B）  毫升

  陰性液（Reagent C）    毫升

  底物液（Reagent D）    微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品制備

• 準(zhǔn)備好500微升待測(cè)細(xì)菌（OD600＝0.8至1，即1至2 X 10⁷細(xì)菌/毫升）
• 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新鮮的1.5毫升離心管——此為占85%細(xì)菌外分泌型酶蛋白
• 加入xx微升  裂解液（Reagent A），充分混勻
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管——此為占細(xì)菌內(nèi)結(jié)合型酶蛋白
• 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－   30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)405nm
• 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent D）手心融化，避免光照

• 活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent B）到相應(yīng)孔里
• 分別加入xx微升  陰性液（Reagent C）或上述制備的待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育30分鐘（注意：可見(jiàn)反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黃色）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)
• 活性計(jì)算：

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

• 比色皿檢測(cè)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為21次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低，即30分鐘讀數(shù)過(guò)低，則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至2小時(shí)；其次增加樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 賴氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾單肽化合物底物所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列牙齦卟啉菌蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感