活體組織氧化應激活性氧（ROS）MitoSOX紅色熒光測定試劑盒（超氧陰離子superoxide）產品說明書（中文版）

主要用途

活體組織氧化應激活性氧（ROS）MitoSOX紅色熒光測定試劑盒（超氧陰離子superoxide）測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑MitoSOX，在線粒體氧化損傷條件下，產生紅色熒光，來檢測細胞內超氧陰離子活性氧族的生成和增加的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中線粒體氧化磷酸化副產物之一是超氧陰離子，為線粒體內主要的活性氧族，與心血管疾病，包括高血壓、冠狀動脈硬化、糖尿病相關的血管疾病、神經退行性疾病（巴金森氏癥、阿茨罕默癥、肌萎縮硬化癥）相關。MitoSOX是一種*自由通過細胞膜，并選擇性在活體細胞線粒體內長期滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，便產生熒光。據此證明細胞線粒體內超氧陰離子活性氧族的存在。

產品內容

  清理液（Reagent A）    毫升

  染色液（Reagent B）    微升

  稀釋液（Reagent C）    毫升

  保存液（Reagent D）    毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞操作所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

培養箱：用于反應孵育

血細胞計數儀：用于細胞計數

臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細胞

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析

實驗步驟

• 間接法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為  染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 準備1瓶25cm²細胞培養瓶的待測細胞
• 小心抽去細胞培養液
• 加入xx毫升   清理液（Reagent A）到細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面
• 小心抽去  清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
• 置入37℃培養箱1分種
• 振動培養瓶，使細胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細胞培養液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細胞計數儀上進行細胞計數
• 移出1 X 10⁶細胞到新的15毫升錐形離心管
• 放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有  染色液（Reagent B）和  稀釋液（Reagent C）的  染色工作液，輕柔混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的xx微升  保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 即刻進行細胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細胞以上――

波峰右移，表明超氧陰離子含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發波長510nm，散發波長580nm――

紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿

2）加入xx微升  保存液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進熒光分光光度儀：激發波長510nm，散發波長580nm――

RFU增高，表明超氧陰離子含量高

• 直接法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為  染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

1．準備1個細胞培養24孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見注意事項5）

2．小心抽去細胞培養液

3．小心沿著孔壁加入xx微升含有  染色液（Reagent B）和  稀釋液（Reagent C）的

  染色工作液到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

4．放進37℃細胞培養箱里孵育20分鐘

5．小心抽去含有  染色工作液 

6．小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的  保存液（Reagent D）到細胞培養孔

7．選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發波長510nm，散發波長580nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀：激發波長510nm，散發波長580nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高

注意事項

• 本產品為20次（1毫升體系）或40次（0.5毫升體系）操作
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，避免光照
• 本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整操作用量：

• 根據細胞類型，調整  染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
• 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞熒光分析
• 本公司同時提供系列超氧陰離子活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰