MB10114.4 v.A

 體液總抗氧化能力比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 體液總抗氧化能力（TAC）比色法定量檢測試劑是一種旨在通過過硫酸鉀的參與，使染料ABTS氧化，在抗氧化劑的存在下，通過分光光度儀，觀察其峰值下降的變化，來定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即抑制氧化等值濃度的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種體液包括血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、精液等各種體液的總抗氧化能力檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風濕性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統內，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過過硫酸鉀（potassium persulfate）氧化2,2’-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）產生的ABTS自由基，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基或者消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（730nm波長）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。

產品內容

 緩沖液（Reagent A）      毫升

 染色液A（Reagent B1） 管

 染色液B（Reagent B2） 毫升

 氧化液（Reagent C）      毫升

 標準液（Reagent D）      微升

產品說明書 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品存放和標準品配制的容器

4℃微型臺式離心機：用于樣品處理

96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色變化

實驗步驟

• 樣品準備

選擇一：血漿樣品

• 準備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• 移取10微升上述制備的血漿到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent A），混勻
• 放在冰槽里待測

選擇二：血清樣品

1． 準備好不含抗凝劑的儲存管

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• 移取10微升上述制備的血清到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent A），混勻
• 放在冰槽里待測

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

• 準備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• 移取10微升到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent A），混勻
• 放在冰槽里待測

二、標準液準備

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent D）到1號管
• 小心移取xx微升 緩沖液（Reagent A）和xx微升 標準液（Reagent D）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升 緩沖液（Reagent A）和xx微升 標準液（Reagent D）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升 緩沖液（Reagent A）和xx微升 標準液（Reagent D）到4號管，混勻
• 小心移取xx微升 緩沖液（Reagent A）到5號管
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 樣品測讀

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取xx毫升 染色液B（Reagent B2）到1管 染色液A（Reagent B1）里，混勻，置于暗室里室溫下孵育過夜（16小時）后，標記為 染色工作液，避免光照。然后進行下列操作。

• 準備1個96孔板，做好標記：空白對照孔、標準對照孔、樣品孔
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent A）到96孔板里的每個孔里
• 分別加入xx微升 染色工作液  
• 分別加入xx微升 氧化液（Reagent C）
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent A）到空白對照孔
• 加入xx微升上述配制的 標準液（Reagent D）到相應標準對照孔里
• 加入10微升體液樣品到樣品孔里
• 輕輕搖動96孔板，使其混勻
• 室溫下孵育1分鐘
• 即刻放進酶標儀里測讀：730nm波長
• 分析結果：
  • 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（OD730nm）；橫座標（X軸）為標準Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 空白對照孔為最大吸光單位（OD730nm）讀數
  • 標準對照孔和樣品孔為實際吸光單位（OD730nm）讀數
  • 根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 計算樣品實際總抗氧化能力

• 根據下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率）

• IC50：50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白濃度（毫克/毫升）或樣品容量（微升）

注意事項

• 本產品為50次操作
• 本產品測試范圍為高濃度30至150微摩爾
• 操作時，須戴手套
• 體液制備的所有操作均須在4℃狀態下進行
• 測試前，樣品須處于新鮮收集
• 樣品須清澈
• 樣品避免含有Tris、EDTA和還原劑等
• 空白對照孔的吸光讀數應為2.0以上，如果低于1.5，不能用于高濃度檢測，須增加 染色工作液的室溫孵育時間
•  染色工作液避免反復在室溫空氣中久置。如果空白對照孔的吸光讀數為3.5以上，建議使用無離子水稀釋到2.5至3.0則可
• 樣品讀數越低，抗氧化能力越高
• 樣本量不宜超過20微升
• 可以使用比色皿檢測
• 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品濃度
• 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液
• 如果用戶沒有730nm波長濾波器，可以使用640nm至810nm之間的任一波長替代；或者使用405nm波長替代
• 人體體液的總抗氧化能力在0.2至2毫摩爾標準水溶性生育酚Trolox的濃度
• 本公司提供低濃度測試試劑產品
• 本公司提供系列抗氧化分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感