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1.消毒物品的初步處理，凡接觸過病原微生物的醫療器械、被單、衣物等均應先用化學消毒劑進行消毒。常規清洗時，先用洗滌劑溶液浸泡擦洗，去除物品上的油污、血垢等污物，然后用流水沖凈。有軸節、齒槽和縫隙的器械和其它物品，應盡可能張開或拆卸，進行洗刷。洗滌后的物品應擦干，按臨床需要分類包裝，以免再污染。清除污染前后物品的容器和運送工具應嚴格區分，以防交叉感染。
3.消毒物品裝放應合理，盡量將同類物品裝在同一鍋內滅菌。物品裝放時，上下左右均應交叉錯開，留出縫隙，使蒸汽容易穿透。大消毒包應立著放上層，小包放下層，布類和金屬類物品同時滅菌時，應將金屬類物品包放在下層，使兩者受熱基本一致，并防止金屬物品滅菌中產生的冷凝水弄濕包布。
4.排盡空氣，使用高壓蒸汽滅菌器時，最關鍵的是將鍋內空氣排盡。關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力到指ding的時間。
5.合理計算滅菌時間，穿透時間，從鍋內達到滅菌溫度開始到鍋內最難達到的部位也達到此溫度所需要的時間；維持時間，即殺滅微生物所需要的時間，一般以殺滅嗜熱脂肪桿菌芽胞所需時間來表示；安全時間，為使滅菌得到確切保證所需要增加的時間，一般為熱死亡時間的一半，其長短視消毒物品而定。
6.開蓋操作，達到滅菌時間后即可切斷電源，在壓力降到0.05MPa，可緩慢放出蒸氣，注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后才能開蓋，取出培養基擺在平臺上以待冷凝，不可久不放氣，否則容易引起培養基成分變化以至無法制作斜面培養基。
7.滅菌后操作，要求消毒物品干燥后檢查指示劑，當達到滅菌要求時可出鍋。取無菌物品時，要嚴格無菌操作，開蓋物品先將蓋蓋好，貯槽關閉好通氣孔。同時應分類放置，順序發放取用。
8.防止超熱蒸汽，超熱蒸汽溫度雖高，但像空氣一樣，遇到消毒物品時不能凝成水，不能釋放潛熱，所以對滅菌不利。防止超熱的辦法是使用外源蒸汽滅菌器時，不要使夾層的溫度高于消毒室的溫度，兩者應相近不要使壓力過高的蒸汽進入消毒室內；滅菌時不要先用壓力高的蒸汽加熱到要求溫度，然后再降至正常壓力。
9.高壓滅菌后不變質的物品，如無菌水、栽培介質、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。
10.含有鹽分的液體漏出或溢出時，一定要及時擦干凈，沿著蓋子的密封圈要擦干，否則會腐蝕容器和管道。
11.不要在爆炸性氣體附近使用儀器。
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